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《上海交通大学》 2008年
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百合LlACO1基因克隆与遗传转化受体系统的建立

许洁婷  
【摘要】： 百合(Lilium)是世界上的五大鲜切花之一,深受人们的喜爱。但是,百合与其它鲜切花一样随着花朵的开放而迅速衰老,如何延长百合花朵的保鲜期已成为近二三十年来百合研究的热点。据研究报道,百合花的衰老与乙烯的产生有关,而ACC氧化酶是乙烯生物合成途径中的一个关键酶,克隆百合ACC氧化酶基因(ACO)并进行调控研究和探索,利用基因工程技术改良百合保鲜期具有重要意义。 本研究以麝香百合为材料,克隆了百合ACO基因并对基因进行了表达分析,进而在ACO反义载体构建、百合遗传转化受体系统建立及农杆菌介导外源基因转化等方面开展一系列工作,取得了以下结果: 1.首次从麝香百合中克隆到了ACC氧化酶基因LlACO1的cDNA全长序列(Genbank No. EU249333)。LlACO1 cDNA全长为1,067 bp,带一短poly(A)尾巴,包含26 bp的5’非翻译区(UTR)和91 bp的3’非翻译区,以及954 bp长的开放读码框(ORF),推导其编码一个含317氨基酸残基、分子量为36.18 kDa、等电点(pI)为5.26的蛋白质。 对LlACO1氨基酸序列进行生物信息学分析和蛋白质结构预测,结果显示,LlACO1与郁金香的同源性最高(86%),其蛋白质序列和结构比较保守,不同物种间的差异不大;具有与oxgenase家族的功能域同源的结构域,在进化关系上与郁金香、兰花等比较近。组织特异表达分析结果表明LlACO1在百合不同器官中的表达有差异。 2.首次从麝香百合基因组中克隆得到了LlACO1全长序列。该基因含有4个外显子和3个内含子。内含子分别位于nt132-312、nt 618-969、nt 1342-1671、大小分别为181bp,79bp,330bp。Southern杂交分析结果表明LlACO1在百合基因组中呈低拷贝分布。 3.建立了百合遗传转化愈伤组织受体系统。以麝香百合幼嫩花部组织为材料,研究筛选出了花丝做为最佳的诱导愈伤组织的外植体,并筛选出了最佳的诱导培养基、增殖培养基、分化培养基和生根培养基,确立了卡那霉素和潮霉素对百合愈伤组织的最佳筛选浓度,为百合的遗传转化奠定了基础。 4.构建了LlACO1的反义表达载体。利用酶切和连接技术把LlACO1的反义片段antiLlACO1连接到pCAMBIA1304上,并保留了gus报告基因。将载体质粒转化至农杆菌EHA105菌种中,获得了用于百合转化的含antiLlACO1的工程菌。 5.利用农杆菌介导法对麝香百合进行了遗传转化,利用GUS染色法研究了外源基因在受体愈伤组织中的瞬时表达,并通过潮霉素筛选及分化诱导获得了一批具有潮霉素抗性的愈伤组织和再生植株。
【关键词】：麝香百合 ACC氧化酶 愈伤组织 卡那霉素 潮霉素 植物反义表达载体
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：S682.29
【目录】：
  • 摘要5-7
  • ABSTRACT7-13
  • 缩写词表13-15
  • 第一章 文献综述15-29
  • 1.1 百合及其衰老研究15-19
  • 1.1.1 百合概述15-16
  • 1.1.2 百合花的衰老与乙烯的关系16-17
  • 1.1.3 乙烯生物合成的途径17-18
  • 1.1.4 花卉中调控乙烯的主要方法18-19
  • 1.2 ACC 氧化酶研究进展19-23
  • 1.2.1 ACC 氧化酶的结构和功能19-20
  • 1.2.2 ACC 氧化酶基因克隆的研究进展20
  • 1.2.3 ACO 基因差异表达的研究进展20-22
  • 1.2.4 ACO 基因在植物基因工程中的应用22-23
  • 1.3 百合愈伤组织再生途径及其遗传转化受体系统研究进展23-27
  • 1.3.1 愈伤组织诱导和培养的条件探索23-25
  • 1.3.2 百合花部愈伤组织再生途径的研究进展25-26
  • 1.3.3 百合植株的再生26-27
  • 1.4 本研究的目的与意义27-29
  • 第二章 麝香百合 ACC 氧化酶基因 LlACO1 克隆及序列分析29-66
  • 2.1 实验材料与试剂29-31
  • 2.1.1 植物材料29
  • 2.1.2 菌株和载体29
  • 2.1.3 主要仪器设备29-30
  • 2.1.4 试剂及试剂盒30-31
  • 2.2 实验方法31-48
  • 2.2.1 百合ACC 氧化酶基因片段的克隆31-37
  • 2.2.2 RACE 法克隆百合ACC 氧化酶基因LlACO1 CDS 全长37-40
  • 2.2.3 百合ACC 氧化酶基因LlACO1 基因组全长序列的克隆40-41
  • 2.2.4 LlACO1 基因的生物信息学分析41
  • 2.2.5 基因组Southern 杂交分析41-45
  • 2.2.6 LlACO1 组织特异性表达分析45-48
  • 2.3 结果与分析48-63
  • 2.3.1 麝香百合叶片总RNA 的提取48
  • 2.3.2 第一链cDNA 的合成及双链cDNA 的扩增48-49
  • 2.3.3 LlACO1 特异片段的克隆49-50
  • 2.3.4 LlACO1 CDS 全长的获得50-54
  • 2.3.5 LlACO1 推导蛋白的序列分析、结构预测和分子进化树分析54-59
  • 2.3.6 LlACO1 基因组序列的克隆59-61
  • 2.3.7 百合LlACO1 基因的Southern 分析61-62
  • 2.3.8 百合LlACO1 基因的组织表达分析62-63
  • 2.4 讨论63-65
  • 2.4.1 LlACO1 基因的克隆63-64
  • 2.4.2 LlACO1 的保守结构分析64
  • 2.4.3 LlACO1 的组织特异表达分析64-65
  • 2.5 本章小结65-66
  • 第三章 麝香百合愈伤组织遗传转化受体系统的建立66-77
  • 3.1 植物材料66
  • 3.2 实验方法66-68
  • 3.2.1 外植体的消毒66
  • 3.2.2 培养基与培养条件66-67
  • 3.2.3 愈伤组织诱导、增殖和分化67
  • 3.2.4 生根培养和移栽67-68
  • 3.2.5 抗生素敏感性试验68
  • 3.3 结果与分析68-73
  • 3.3.1 高频再生系统的建立68-72
  • 3.3.2 抗生素敏感性试验72-73
  • 3.4 讨论73-76
  • 3.4.1 百合花部器官外植体的消毒73-74
  • 3.4.2 外植体的生理状态对百合愈伤组织诱导和植株再生的影响74
  • 3.4.3 植物生长调节物质对百合花部组织愈伤组织诱导和植株再生的影响74-75
  • 3.4.4 再生苗玻璃化的原因及应对策略75-76
  • 3.5 本章小结76-77
  • 第四章 LlACO1 反义表达载体的构建及对百合的遗传转化的初步研究77-90
  • 4.1 实验材料77
  • 4.1.1 植物材料77
  • 4.1.2 质粒及菌种77
  • 4.2 实验方法77-82
  • 4.2.1 LlACO1 植物反义表达载体的构建77-80
  • 4.2.2 植物表达载体转化农杆菌EHA10580-81
  • 4.2.3 农杆菌EHA105 介导的p1304－antiLlACO1 转化麝香百合81-82
  • 4.3 结果与分析82-87
  • 4.3.1 植物表达载体p1304－antiLlACO1 的构建82-84
  • 4.3.2 植物表达载体转化农杆菌EHA10584-85
  • 4.3.3 农杆菌EHA105 介导的p1304-antiLlACO1 转化麝香百合85-87
  • 4.4 讨论87-88
  • 4.4.1 LlACO1 反义载体的构建87-88
  • 4.4.2 gus 染色检测外源基因在愈伤组织细胞的初步转化88
  • 4.5 本章小结88-90
  • 第五章 结论与展望90-92
  • 5.1 研究结论90
  • 5.2 后续研究方向90-92
  • 参考文献92-98
  • 致谢98-99
  • 攻读学位期间发表的论文99

【引证文献】
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