甜瓜谷氨酰胺合成酶基因的克隆和功能研究

【摘要】： 谷氨酰胺合成酶(GS; EC 6.3.1.2)是植物N素同化途径中最为关键的催化酶之一,被称为是植物中无机态N转化为有机态N的“门户”,对植物N素吸收、同化和利用效率(Nitrogen use efficiency)有着极为重要的影响。高等植物中的GS同工酶主要分为两类:胞质型GS1主要同化从土壤吸收的初级氨及再同化从植物体内各个N循环途径所释放的氨;质体型GS2同化由NO3--N还原而来及光呼吸过程所释放的氨。N素供应对甜瓜的生长发育、果实的产量和品质形成有非常重要的影响,目前甜瓜N素代谢研究还停留在N营养生理与果实品质及产量层面,在分子机理水平的研究报道很少,尤其是对与N素同化和利用效率紧密相关的GS酶基因的研究还是空白。因此,本文以甜瓜作为对象,在从甜瓜中克隆出首个胞质型GS基因M-GS1的基础上,对M-GS1及课题组克隆到的首个甜瓜质体型GS基因M-GS2的基因组拷贝数、表达产物的亚细胞定位及生化特性、在甜瓜中的表达调控特征等进行了研究和对比分析,从基因、蛋白质和细胞水平对甜瓜GS基因进行了系统的功能验证和鉴定,开展了甜瓜N营养代谢的分子生理研究;进而在植株水平研究M-GS1在转基因超量表达后提高植株N素同化效率的潜能,为甜瓜GS基因的应用、利用GS基因改良植物N素利用效率的研究提供新的材料和依据。主要研究结果如下。 1、甜瓜胞质型谷氨酰胺合成酶基因的克隆及生物信息学分析 本研究采用RACE-PCR方法从甜瓜(Cucumis melo L. var. reticulatus Naud.)品种“春丽”中克隆出首个GS1基因M-GS1(GenBank登录号: DQ851867)的全长cDNA序列,并利用生物信息学手段分析其主要结构和功能特征。该基因全长1494 bp,含一个1068 bp的开放阅读框(ORF),推测编码一个由356个氨基酸残基组成的多肽。氨基酸序列比对结果显示,M-GS1与源自其它植物的GS1有较高的同源性;氨基酸序列分析显示该蛋白具有植物GS同工酶的典型结构特征:内含一个GS beta-Grasp域和一个GS catalytic域,以及分别存在于这两个域中的两个活性中心(motif)——一个GS指纹区和一个GS ATP结合区。对M-GS1三级立体结构的预测分析显示,它与通过X光衍射鉴定的晶体GS结构一致,其立体结构的正确折叠需要有Mn2+、AMP及Citric acid等3个配体的存在。系统进化树分析表明,M-GS1与北美假大麻(Datisca glomerata)GS1在分子进化关系上最相近,提示二者可能是同源进化的结果。 2、甜瓜谷氨酰胺合成酶基因的基因组拷贝数 对M-GS1及课题组克隆到的首个甜瓜质体型GS基因M-GS2(GenBank登录号: AY773090)在甜瓜基因组中的拷贝数进行了对比分析。Southern blot结果显示,在甜瓜基因组中,M-GS1可能被一个由2到3个基因成员组成的基因家族所编码,而M-GS2则由单个基因编码。 3、甜瓜谷氨酰胺合成酶的亚细胞定位 通过将甜瓜M-GS1及M-GS2基因分别与报告基因——黄色荧光蛋白YFP基因融合,构建重组植物表达载体(pA7-GS1::YFP和pA7-GS2::YFP),应用基因枪法转入洋葱内表皮细胞中进行瞬时表达,然后在激光扫描共聚焦显微镜下,对表达产物在洋葱内表皮细胞内的分布情况进行了观察和分析。结果显示,融合蛋白M-GS1::YFP定位于洋葱内表皮细胞的细胞质中,而融合蛋白M-GS2::YFP则定位于洋葱内表皮细胞的质体中。这些结果在细胞水平证实了甜瓜M-GS1和M-GS2蛋白确实具有其自身所属同工酶类别(GS1或GS2)通常所应具有的亚细胞定位特性。 4、甜瓜谷氨酰胺合成酶基因的原核表达及产物GS酶活性相关分析 为了对甜瓜M-GS1及M-GS2各自所编码的GS酶的生化功能和属性有准确的了解,本实验分别对M-GS1编码区、M-GS2编码区及去除跨肽cTP序列的M-GS2编码区(M-GS2-cTP)成功地进行了原核表达,用Ni–NTA亲和色谱法纯化得到了各对应的重组蛋白。SDS-PAGE电泳结果显示,重组M-GS1、M-GS2和M-GS2-cTP蛋白的分子量分别为41 kDa、50 kDa和44 kDa。分析各重组蛋白质的谷氨酰胺合成酶催化特性显示,只有重组M-GS1蛋白质和重组M-GS2-cTP蛋白质具有GS酶催化活性,而未切除cTP序列的重组M-GS2蛋白质无GS催化活性;M-GS1比M-GS2-cTP具有更高的NH4+亲和性和GS酶合成酶活性,但其热稳定性相对更低;两种甜瓜GS酶的活性明显受Mg2+浓度的调节。这些结果进一步在蛋白质水平证实M-GS1和M-GS2为谷氨酰胺合成酶基因,而它们的表达产物具有各自不同的生化特性。 5、不同形态N营养施养处理对甜瓜中谷氨酰胺合成酶基因表达的调控 用实时荧光定量PCR方法,分析不同形态N素施养处理对甜瓜M-GS1及M-GS2表达的潜在调控作用。结果显示,不同形态的N素施养处理对甜瓜中M-GS1及M-GS2的表达呈现不同的调节模式。NH4+-N和NO3--N中、低浓度(3.75 mM或0.75 mM)施养处理仅对甜瓜叶片中M-GS2的表达有显著的调节作用;足量的N素营养浓度水平(7.5 mM)施养处理则对M-GS2表达量无明显调节作用。然而,谷氨酸施养处理,不仅调节M-GS2在叶片中的表达(开始降低而后升高到一个比对照高的水平),还调节其在根中的表达;对甜瓜根中M-GS1表达产生抑制作用,对其在叶片和茎中的表达则无明显影响。NH4+-N施养处理能刺激M-GS1基因在甜瓜苗根、茎、叶中的表达,而NO3--N则仅刺激其在甜瓜根和叶中的表达。以上结果表明,正是由于不同的GS同工酶基因有不同的表达调节特性,具有差异化的生理功能,才能保证植物在应对现实生长环境中不断变化的N营养供应状况时其N素同化作用得以正常进行。 6、甜瓜M-GS1转基因超量表达对拟南芥N相关生理生化的影响 将甜瓜M-GS1基因正确构建于植物表达载体pEZT-NL中,获得含目的基因的植物表达载体EHA105-35S::M-GS1::EGFP。在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105的介导下,通过浸花法(Floral-dip)再将构建的植物表达载体转入拟南芥。通过除草剂筛选及基因组DNA PCR验证,获得了十个独立的转M-GS1基因株系。提取独立转基因株系总RNA进行RT-PCR分析,结果显示,M-GS1在各独立转基因株系中均检测到了表达。正常(7 mM)及低N素(1mM)水平培养实验发现,转M-GS1基因对植株生长生化指标的影响只在低N素水平培养时显著表现。生化及生长分析显示,在低N素供应时,各M-GS1转基因株系莲座叶(rosette)的总GS酶活性、总可溶性蛋白含量和生物量均显著地高于野生型拟南芥植株。这些结果表明,M-GS1基因的超量表达具有在低N素供应环境下维持转基因植株N素同化利用效率的潜能。