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鞘氨醇单胞菌DP58降解吩嗪-1-羧酸(PCA)分子机理的研究

屈丽  
【摘要】: 新型生物农药申嗪霉素,其有效成分为吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid, PCA),对甜椒疫病和西瓜枯萎病的防治具有广谱、高效、低毒、环境相容性好、生产成本低等显著特点。但在生物防治过程中发现,PCA在大田中易被降解,影响其防治效果,因此需要研究PCA的生物降解机理,了解它的环境行为,为提高申嗪霉素的防治效果、合理使用申嗪霉素奠定基础。本实验室在此前的研究中已经筛选出能够高效降解PCA的菌株——鞘氨醇单胞菌DP58,并对其降解PCA的特性和降解产物进行了探索。 本论文着重研究鞘氨醇单胞菌DP58降解PCA的分子机理。首先,提取鞘氨醇单胞菌DP58全基因组,并使用基因Shear仪将样品随机打断成主带约为6-8kb的片段、再与pUC118载体连接,构建6-8kb的Shotgun基因文库。经过文库检验,以邻苯二酚为显色指示剂从文库中筛选到阳性转化子。然后,以PCA为唯一碳、氮源,将阳性转化子接种于PCA无机盐溶液中,发现其对PCA有一定的降解能力,遂将阳性转化子进行基因测序。根据测序结果,运用NCBI的BLASTn工具,通过网络数据库(http://www.ncbi. nlm. nih.gov/BLAST/)进行比对,了解到转化子插入片段含有五个开放阅读框(orf1-orf5),其中orf2-orf4为完整的开放阅读框,分别与鞘氨醇单胞菌RW1(Sphingomonas sp.Strain RW1)EDO2基因簇中三个连续基因—EDO2、ORFG3和ORFG4相似,相似度达到98%。 将筛选出的基因,对比其在文献报道中的功能,有选择的克隆于pEASY-E1载体T7启动子下,并转化到大肠杆菌BL-21中,验证其降解功能。由此发现,orf2与orf4基因所编码的酶在降解中共同起作用,并且都利用了orf3基因所编码的电子传递链。此外,在过表达orf2- orf3- orf4基因的PCA无机盐培养基中,我们分离得到了不稳定的紫色物质,并对其进行了液质联用质谱(LC-MS)检测。检测结果与之前推测的降解中间产物的分子量相吻合,由此,我们对PCA的降解途径进行了进一步的补充和推测。


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