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《上海交通大学》 2010年
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产紫杉烷类物质内生真菌的分离鉴定

朱慧芳  
【摘要】: 紫杉醇是Wani等人1971年从短叶红豆杉(Taxus brevifolia)的树皮、树根及枝叶中提取的一种四环二萜酰胺类化合物,是一种高效、低毒、广谱天然抗癌药物,紫杉醇的天然提取主要来自于红豆杉植物(Taxus)的皮,其含量仅为0.01%~0.05%。红豆杉属于濒危树种,生长极慢,传统方法需要砍伐大量紫杉树木,取其树皮提取紫杉醇,其代价很高,据推算每300棵树,大约能有10吨树皮,可提取1kg左右的紫杉醇,约能供应5个患者使用;因此,寻求获得紫杉醇的新途径,是保护红豆杉资源和降低药物治疗成本的关键,为此与紫杉醇生产相关的领域,如化学合成、植物组织细胞培养和微生物发酵等均做了大量的研究工作。特别是在微生物发酵方面,紫杉醇内生真菌的分离和鉴定,为人们展示了一个生产紫杉醇的新途径。 本研究从野生中国红豆杉(Taxus chinensis (Pilger) Rehd.)的不同组织中分离到了123株内生真菌,通过HPLC检测发现了4株产紫杉烷类物质的内生真菌,分别命名为Cbr31-1、Cbr34-1、Cbr37-2和Cbr51-2。使用真菌ITS rDNA通用引物序列,对分离菌Cbr1-1、Cbr31-1、Cbr31-3、Cbr34-1、Cbr37-2、Cbr38-2、Cbr44-3、Cbr46-2和Cbr51-2和的ITS序列进行了PCR扩增,并对扩增产物进行了测序,对这9株分离菌进行了初步的种属归类,并进行了进化树分析。 优化了色谱条件,利用高效液相对天然生长的南方红豆杉、中国红豆杉和东北红豆杉枝条中的3种紫杉烷类物质含量进行了检测和分析。把3种紫杉烷类化合物:10-脱乙酰巴卡亭III (10-deacetyl-baccatin III)、巴卡亭III (baccatin III)和紫杉醇(Taxol)置于同一色谱条件下检测,以比较不同种类紫杉烷类化合物的含量,为红豆杉资源的开发和利用奠定了基础,也为产紫杉烷类物质内生真菌发酵产物的提取与检测建立了平台。 对产紫杉醇基因工程菌株EFY-21进行了发酵条件的研究,实验采用了不同的基础培养基、温度、pH等因素对EFY-21基因工程菌进行对比实验确定最佳培养条件,进行了生长曲线的测定以及培养条件的优化,确定了最佳碳氮源的培养基,并采用正交实验得出最佳的碳氮比例,为将来利用转基因内生真菌大规模生产紫杉醇奠定了基础。
【学位授予单位】:上海交通大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:Q93

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