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《上海交通大学》 2010年
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猪链球菌噬菌体SMP的抑菌作用及其增殖动力学研究

庞亮亮  
【摘要】: 猪链球菌病一直是困扰养猪业的重要疾病,特别是随着抗生素的滥用,猪链球菌对抗生素呈现严重耐药和多重耐药,给该病的防控带来新的困难。开发新型抗菌制剂显得非常重要,而噬菌体作为抗菌制剂颇具应用潜力。 本文通过对猪链球菌2型及其烈性噬菌体SMP全长基因序列的分析,建立了能同时检测噬菌体和猪链球菌的通用PCR方法;并建立了能分别检测猪链球菌2型或其噬菌体的快速荧光定量PCR方法;应用猪链球菌攻击CD1小鼠后,用猪链球菌烈性噬菌体SMP进行治疗,结果显示该噬菌体具有治疗猪链球菌感染的可行性;初步探索了噬菌体与猪链球菌互作的动力学关系,为进一步应用噬菌体进行猪链球菌病治疗奠定了基础。 实验发现对猪链球菌噬菌体的分离存在很大难度,应用双层琼脂培养法挑取噬菌斑的传统分离方法具有诸多局限性,为了解决这一问题,以健康巴马香猪鼻拭子样本中分离出的一株SS2的烈性噬菌体SMP为模板,建立了猪链球菌2型及其噬菌体的通用PCR检测技术,该方法可以同时检测细菌和噬菌体的存在与否。通过比较噬菌体SMP和其他99株链球菌或噬菌体的基因组发现,SMP虽然保守区段很多,但却很短,其中主要有int、lysin等基因,而single strand binding gene在blast结果中显得最保守。针对single-stand binding gene序列设计引物,建立了PCR检测方法,可在猪链球菌和噬菌体SMP的目标区段检测到条带,回收测序证明是目标条带,而在对照组大肠杆菌及其噬菌体中未发现条带。通过优化PCR反应条件,检测下限可达103cfu/mL。应用该方法可以同时筛选到噬菌体和相关宿主菌,可提高噬菌体的分离概率。进一步通过200nm滤膜过滤,可实现噬菌体和细菌的分离,并可通过下述的噬菌体快速荧光定量PCR检测技术确认噬菌体的存在。通用检测可实现对猪链球菌2型烈性噬菌体有无的快速初步鉴定,甚至溶源阶段的噬菌体也可以检测。利用该方法,可加快噬菌体的分离工作,比传统的“盲传”分离更加高效。另外,通用检测方法可以应用到前噬菌体分析中,这是首次提出用PCR进行猪链球菌前噬菌体检测。 为了评估烈性噬菌体在动物实验中对猪链球菌2型的抑菌作用、研究噬菌体和猪链球菌2型互作后各自的消长情况,以评价烈性噬菌体对感染猪链球菌动物的保护力,针对猪链球菌2型及其噬菌体SMP分别建立了快速荧光定量PCR检测技术。本文使用猪链球菌溶菌酶释放蛋白(Muramidase-released protein, MRP)毒力基因mrp作为猪链球菌检测的目标基因。结果显示,猪链球菌快速荧光PCR检测技术可以在30分钟内把猪链球菌2型鉴定出来并实现定量,定量的下限低于30个模板每毫升,特异性实验显示它可以很好地排除大肠杆菌及其噬菌体、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌和其自身噬菌体SMP等的干扰。 在噬菌体SMP快速荧光定量PCR检测中,选用lysin作为目标基因,同样噬菌体SMP快速荧光PCR检测可在30分钟内鉴定出SMP并实现定量,定量下限低于30个模板每毫升,特异性实验显示它可以很好地排除大肠杆菌及其噬菌体、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌和猪链球菌等的干扰。结合噬菌体SMP快速荧光定量PCR检测和猪链球菌与噬菌体通用检测,把猪链球菌与噬菌体通用检测作为一级检测、噬菌体SMP快速荧光定量PCR检测作为二级检测,可以很方便地检测到猪链球菌噬菌体,为噬菌体分离提供便利。 通过计算噬菌斑、平板裂解、细菌与噬菌体共培养后的浊度测定可定性了解噬菌体SMP的杀菌能力。为了进一步定量分析细菌与噬菌体的互作动力学特征,本文进行了细菌与噬菌体共培养的定量实验。将猪链球菌2型与噬菌体SMP共同培养,每隔一定时间取样,使用荧光定量PCR测算细菌与噬菌体的数量。为了更好地研究噬菌体与其宿主菌的动态关系,定量实验中建立了捕食者数学模型,并根据定量实验的数据,拟合出结果。定性实验和定量试验都显示噬菌体SMP具有良好的杀菌和抑菌能力,这为SMP的治疗性应用提供了可能。数学模型拟合结果显示SMP与其宿主菌可以适用捕食者模型,首次提出用生态数学模型来模拟微生物之间的关系,为噬菌体与其宿主菌的互作关系研究提出一条可行性路线,为应用噬菌体治疗提供了理论基础。 为了研究噬菌体SMP对猪链球菌感染的治疗作用,确认SMP对感染猪链球菌2型的动物具有保护力,进行了小鼠攻击保护试验。以CD1小鼠作为模式动物,在用猪链球菌攻击后,采用静脉注射SMP进行噬菌体体内抗菌活性研究。通过统计噬菌体处理组和细菌攻击对照组小鼠体内的细菌增殖情况,揭示了噬菌体对活体动物具有杀菌效果。试验研究了噬菌体SMP对猪链球菌SS2-4的抗感染效果。将小鼠分为4组,分别是PBS阴性对照、噬菌体对照、细菌攻击对照、细菌攻击后噬菌体处理。采用尾静脉注射,每隔一定时间眼眶采血,连续观察不同组中细菌和噬菌体数量的变化。结果表明,噬菌体对猪链球菌有杀菌作用,噬菌体能加速小鼠体内的细菌减少,同时会降低细菌高峰期的峰值,对小鼠存在明显的保护作用。CD1小鼠感染猪链球菌后通过注射SMP可显著降低血液中猪链球菌数量的事实提示,SMP可作为防控猪链球菌病的一种高效抗感染制剂。
【学位授予单位】:上海交通大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S852.611

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 薛晓昀;大豆根瘤菌与促生菌复合系筛选及机理研究[D];中国农业科学院;2011年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国博士学位论文全文数据库 前1条
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【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 慕小凤;猪链球菌2型IgA1 protease的鉴定及致病性研究[D];华中农业大学;2010年
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【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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8 佟丽娜;李淑敏;孟令波;;双接种对大豆利用不同有机磷源的影响[J];东北农业大学学报;2009年10期
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中国博士学位论文全文数据库 前5条
1 亓苏伟;费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)盐胁迫蛋白质组学的研究[D];中国农业大学;2004年
2 杨平仿;水稻幼苗脱黄化过程以及灌浆期茎的蛋白质组学研究[D];中国科学院研究生院(植物研究所);2005年
3 师尚礼;甘肃寒旱区苜蓿根瘤菌促生能力影响因子分析及高效促生菌株筛选研究[D];甘肃农业大学;2005年
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5 吴志强;太平洋磷虾(Euphausia pacifica Hansen)胰蛋白酶样酶酶学性质及基因片段研究[D];中国海洋大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前8条
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中国硕士学位论文全文数据库 前3条
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中国期刊全文数据库 前10条
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【相似文献】
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2 陈莉;SMP机群上的并行代码优化技术[D];中国科学院研究生院(计算技术研究所);2002年
中国硕士学位论文全文数据库 前7条
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3 毛紫微;猪链球菌噬菌体SMP末端酶大亚单位的生物学活性研究[D];上海交通大学;2013年
4 张丹丹;基于SMP机群的层次化编程模型的设计及实现[D];曲阜师范大学;2013年
5 张举;基于SMP多核系统异常监控处理系统的设计与实现[D];西安电子科技大学;2014年
6 李娇娇;面向SMP架构处理器平台操作系统主要模块的设计与实现[D];西安电子科技大学;2012年
7 谭膺;基于SMP的并行游戏树搜索程序负载分析研究[D];电子科技大学;2006年
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