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《上海交通大学》 2010年
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猪链球菌多重PCR检测方法的建立及屠宰场样品感染率的调查研究

郑升博  
【摘要】: 猪链球菌(Streptococcus suis, SS)是一种重要的人兽共患病原菌,主要引起猪和人类的脑膜炎、败血症及突发性死亡,对养猪业造成巨大损失的同时,严重威胁人类公共卫生安全。根据菌体荚膜多糖抗原特性的不同,可分为35个血清型(1~34型,1/2型),其中以2型流行最广、致病性最强,其次是7型和9型。目前研究认为SS致病性与其相关毒力因子的携带与表达密切相关。 本研究首先根据标准菌株建立多重PCR方法并对方法进行评价,随后根据所建立方法初步设计了检测试剂盒;应用本研究所建立的多重PCR方法对分离自扁桃体样品中的猪链球菌进行分型与毒力因子的检测,并用斑马鱼模型对12株SS2的致病力进行了比较。 一、猪链球菌2、7、9型多重PCR检测方法建立与应用 根据相关文献及Genbank上猪链球菌序列,设计合成10对引物,通过在3个PCR反应体系中的组合优化,建立了一种涵盖7种猪链球菌主要毒力因子mrp、epf、sly、gdh、gapdh、orf2和fbps及2、7、9型分型的多重PCR检测方法。特异性和敏感性试验结果表明该法特异性强,多重PCR敏感性可达103CFU。最后根据所建立方法设计组装试剂盒并拟定操作说明书,通过重复性试验和保存期试验,证明试剂盒的批内、批间重复性好,可在-20℃条件下保存4个月。 二、扁桃体样品中猪链球菌的调查与2型分离菌株的毒力比较 2008年-2009年期间,分别在上海、安徽和广东三地屠宰场采集屠宰后猪的扁桃体样品,对所采399份样品中猪链球菌的携带率以及血清分型进行PCR检测。结果显示SS总体阳性率(16S rRNA+)为9.27% (37份);分离到23株SS。其中2型有16株、7型有3株和9型有4株;14份(3.5%)样品16S rRNA阳性但具体血清型待定。所有2型分离菌株中,有9株毒力因子表型为mrp+epf+fbps+gdh+orf2+sly+ gapdh+;其它分离菌株均存在不同毒力因子缺失。 随后选用800多尾斑马鱼(Danio rerio)对上述9株2型分离菌株以及SH-07YH、ZY05719和HA9801共计12株细菌致病力进行比较。结果斑马鱼接种细菌12h后呈败血症病变,96h内的半数致死量(LD50)在9.07×103至1.02×105CFU之间。从死亡的斑马鱼体内可分离到的细菌,经革兰氏染色和PCR验证均证实为SS2。另外PBS对照组接种后96h内不表现任何病变,亦无死亡。结果表明斑马鱼对SS2强致病株易感。
【学位授予单位】:上海交通大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S855.11

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