多拷贝毕赤酵母重组菌表达PIP生理特性和动力学研究

【摘要】：胰岛素是治疗糖尿病的特效药物之一。本文以本实验室已构建的猪胰岛素前体(porcine insulin precursor, PIP)拷贝数分别为1、6、12和18 Mut+型毕赤酵母重组菌为研究对象,考察不同拷贝数毕赤酵母重组菌表达PIP的发酵过程中毕赤酵母生理特性变化和建立发酵动力学模型,同时建立了多拷贝菌株高表达的混合补料策略。 (1)通过5L罐补料分批培养,比较拷贝数对毕赤酵母生长、细胞存活率、基因稳定性和OUR等影响,结果表明：在甘油相和诱导初期拷贝数对毕赤酵母的生长无显著影响,但是在诱导24h后高拷贝毕赤酵母菌株(12拷贝重组菌A2和18拷贝重组菌A3)比生长速率明显比低拷贝菌株(1拷贝重组菌G1和6拷贝重组菌G6)比生长速率慢,A3菌株细胞存活率仅为75%,且其外源基因丢失率高达19.4%；四种拷贝数毕赤酵母重组菌中,PIP蛋白产量在12拷贝菌株中最高,为702mg/L。 (2)建立发酵过程的菌体生长、产物生成和甲醇累计消耗的动力学模型,确定了模型参数μm、Xm、α、β、κ1、κ2,结果表明发酵的实验值与模型曲线基本吻合,所建立的甲醇补料动力学模型能较好地反映多拷贝毕赤酵母发酵过程,并且模型中与细胞生长相关的产物合成系数α随着拷贝数的增加而增加,说明高拷贝菌株的细胞生长与PIP蛋白表达量具有更紧密的关系。 (3)为解决高拷贝菌株生长缓慢问题和提高PIP蛋白表达水平,建立了山梨醇／甲醇混合补料的培养方式,考察了诱导阶段混合补料对不同拷贝数菌株生长和PIP蛋白表达的影响。与仅用甲醇做唯一碳源和能源相比,山梨醇的补入使G1、G6、A2和A3菌株PIP蛋白表达量分别提高1.9%、42.6%、34.7%和80.9%,这可能由于山梨醇和甲醇混合补料使高拷贝菌株细胞存活率上升,比生长速率增加所致。

【关键词】：重组毕赤酵母 猪胰岛素前体 拷贝数 生理特性 动力学模型 混合补料策略
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：Q78
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