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《华东理工大学》 2011年
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Withanolide类成分的活性筛选及抗自身免疫性疾病的实验研究

孙丽娟  
【摘要】:Withanolide类型化合物是一类具有28个碳原子的麦角甾烷型的化合物,其特征性结构是22位与26位碳连接形成一个δ内酯环的侧链。Withanolide不仅可以用来表示麦角甾烷型的22,26-内酯,也包括与之有生源关系的化合物。这类化合物主要分布在茄科植物中,具有抗炎,抗菌,抗病毒,抗微生物,抗氧化,抗肿瘤,抗惊厥,以及抑制乙酰胆碱酯酶的活性。本课题首先对茄科植物的Withanolide部位进行了活性检测,结果显示该部位具有较强的免疫抑制生物活性。继续采用生物追踪法,由合作实验室对该Withanolide部位进一步的分离纯化,得到一系列Withanolide单体化合物。采用体外细胞增殖模型,通过对这些化合物进行免疫抑制活性的筛选。结果发现,Withangulatin A(WA), Physagulin L, Physalin H等都具有显著的免疫抑制活性。根据筛选结果,初步总结出Withanolide骨架化合物免疫抑制活性的构效关系。本论文在此基础上以WA为代表,深入探讨其抗自身免疫性疾病的具体作用机理。 本论文研究了WA对正常的淋巴细胞、异常增殖的淋巴细胞和混合淋巴细胞的增殖抑制活性,与阳性药物环胞菌素A (CsA)进行比较,结果显示,WA具有较CsA毒性更低,免疫抑制活性更强的潜在作用。小鼠耳廓肿胀实验结果显示,WA同样具有比CsA作用更强的抑制小鼠耳廓肿胀的抗炎作用,且对小鼠的体重影响更小。这为深入探索WA的免疫抑制活性提供了重要的理论基础。 本论文分别从调节淋巴细胞周期,细胞亚型和Th1/Th2型细胞因子平衡等方面对WA免疫抑制活性机理进行了初步的探索。流式细胞技术结果表明WA通过阻滞细胞从G1期到S期的转换,从而阻滞T淋巴细胞有丝分裂的完成;抑制CD4+/CD8+和CD25+细胞亚型,提高了抑制性T淋巴细胞相对数量来抑制淋巴细胞的异常增殖。体内外ELISA结果显示WA调节Th1/Th2型细胞因子平衡是其免疫抑制活性的作用机理之一。 本论文研究了WA对保护性基因HO-1的调节作用。HO-1具有调节免疫,保护细胞损伤等作用,因此诱导HO-1表达在免疫调节方面将成为一种新型的治疗方法。本研究选择HO-1作为分子靶点,对WA免疫抑制的作用机理进行探讨。Western blot和RT-PCR结果显示,WA通过ERK/MAPK途径,呈浓度和时间依赖性地促进小鼠淋巴细胞中HO-1蛋白和mRNA的表达。采用Western blot方法,继续分析了NF-κB p65核内外的表达水平,结果表明WA抑制NF-κB p65核转位效应,与HO-1表达具有直接或间接联系,同时可能参与WA上调过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ),下调环氧合酶-2(COX-2)表达的作用。 本论文建立了基于双荧光素酶报告基因法的特异性抑制COX-2表达的体外分子筛选模型。荧光素酶报告基因法是检测基因启动子活性的一种有效的方法,具有检测速度快、灵敏度高、费用低、不需使用放射性同位素等优点。该模型通过分别构建含有COX-1和COX-2基因启动子的荧光素酶报告基因载体,并同海肾荧光素酶报告基因载体共同组成双荧光素酶报告基因系统,采用脂质体法将两个载体共转染到细胞中,利用化学发光仪测定荧光强度变化,从而分别反映出COX-1和COX-2基因启动子的活性。本研究利用COX-2特异性抑制剂的阳性药物Celecoxib对该分子模型进行了验证,结果显示该模型可信度高、灵敏度高及适于大规模筛选。由于该模型中荧光强度仅仅由COX-2启动子的活性调控,由于该启动子区域中包含特定的已知作用位点,因此还适用于特异性抑制COX-2表达的分子机理探讨。 基于双荧光素酶报告基因的分析结果,本研究进一步对WA特异性抑制COX-2的分子机理进行了探索。Western Blot和PCR等实验结果表明WA通过抑制ERK/MAPK、p38/MAPK途径和抑制NF-κB p65核转位来特异性地抑制COX-2的蛋白和基因表达,进而降低其PGE2产量,而对COX-1表达几乎没有影响。MAPK的三种抑制剂参与NF-κB核转位的结果表明,MAPK可能参与COX-2启动子上除NF-κB以外的其他作用位点来调控COX-2的表达。 本论文利用成熟的MRL/lpr红斑狼疮小鼠,初步探讨了WA对系统性红斑狼疮疾病的治疗作用。结果表明WA可能通过BAFF/BAFF-R通路,有效改善免疫状况,减轻脾脏及淋巴结肿大,同时显著改善MRL/lpr小鼠的肾脏和肺功能,减轻蛋白尿症状和降低血清中抗ds-DNA水平,延长小鼠平均生存期,进一步验证了WA用于治疗系统性红斑狼疮的潜力。 本论文分别从体外的细胞和分子水平,体内炎症和MRL/lpr红斑狼疮鼠模型等几个方面对WA的免疫抑制活性这一新用途进行了多方面、多角度的研究。结果表明WA通过阻滞小鼠T淋巴细胞有丝分裂的完成,抑制CD4+/CD8+和CD25+细胞亚型和调节Th1/Th2型细胞因子的平衡来抑制淋巴细胞的异常增殖;同时上调保护性基因HO-1的表达,特异性地抑制炎症因子COX-2表达来发挥其免疫抑制活性。此外WA对炎症小鼠和红斑狼疮小鼠均有很好的治疗作用。以上实验结果为进一步开发和利用WA以及Withanolide类成分的新的免疫抑制活性提供了科学依据。
【学位授予单位】:华东理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R593

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