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《华东理工大学》 2012年
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微生物脂肽制备条件优化及其衍生化反应的特征

赵越  
【摘要】:微生物脂肽(Lipopeptide)是一类重要的生物表面活性剂,因其突出的表/界面活性和生物活性,在生物医药、食品、化妆品和石油等领域有着重要的应用前景。由于脂肽是一类结构多样的物质,目前对脂肽制备条件及其衍生化反应的认识还非常有限。本文以表面活性素(Surfactin)为主要研究对象,改进了现有制备条件,获得了较高纯度的Surfactin样品,研究了Surfactin水解反应条件及酯化反应动力学,取得了以下主要成果。 以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis HSO121为脂肽产生菌,经过发酵、离心、酸沉、洗涤、乙醚浸提及高效液相纯化等步骤,获得了Surfactin样品。在上述制备过程中,严格控制酸性溶剂和醇溶剂与样品接触的时间,缩短制备的步骤及操作的时间,样品纯度为98.6%。通过高效液相色谱分离得到一系列脂肪酸碳链长度分别为13、14、15的Surfactin同系物,研究比较了它们的表面活性。 通过对水解方法和反应条件的研究,确定了Surfactin酸性水解的最佳条件:6.0mol/L盐酸、90℃下反应24h。当酸性水解温度由常用的110℃降低至90℃,β-羟基脂肪酸脱水率由34%降低至5%,样品中羟基脂肪酸的完好度得到了提高。此外,脂肽水解温度能够降低至水的沸点以下,使得操作更为安全和便利,且释放的脂肪酸总量不变。确定了Surfactin内酯键断裂发生部分水解反应的条件为0.1mol/L NaOH、80℃下反应60mmin。利用高效液相色谱分离得到一组脂肪酸碳链长度分别为13、14、15的线性Surfactin样品,并分别测定了样品的表面活性。 建立了一种准确定量测定Surfactin及其各个组分含量的方法。酸性水解后的Surfactin样品经由三甲基硅烷化试剂(BSTFA)在60℃下反应20mmin,再利用气质联用对样品进行检测,确定样品中氨基酸和脂肪酸的组成。根据氨基酸标准浓度工作曲线及Surfactin各个组分与氨基酸、脂肪酸的对应关系,确定该样品的总摩尔量为4.80×10-7moo1。积分分析谱图中所识别到的羟基脂肪酸峰,分别得到该样品中9种同系物的比例:n C12(0.32%)、iso C13(4.89%)、anteisoC13(6.27%)、iso C14(23.05%)、nC14(8.95%)、iso C15(17.69%)、anteisoC15(38.69%)、iso C16(0.07%)和n C16(0.07%)。结合样品总摩尔量、同系物比例及其对应的分子量,得出每个同系物的质量,加合后得到该Surfactin样品的质量为493μg(纯度98.6%)。该定量方法是目前唯一可测定Surfactin异构体含量的方法,并且适用于已知肽链组成的其他微生物脂肽。 研究了脂肽的酯化反应动力学。对脂肪酸部分碳链长度不同的Surfactin,以酸性甲醇为溶剂,分别分析了其生成单酯化或双酯化Surfactin的反应过程。在4℃、25℃和45℃三个温度下,利用高效液相色谱检测多组反应时间不同的酯化样品,建立了在三氟乙酸的催化下,Surfactin在甲醇溶剂中的酯化动力学模型。结果表明,Surfactin单酯化的反应速率系数远大于双酯化的反应速率系数;Surfactin脂肪酸碳链长度越大,反应速率系数越大,活化能越小。根据实验的结果,确定了在这三个温度下,脂肪酸碳链长度不同的Surfactin可储存的最长时间,即样品的酯化度低于10%的时间。该结果对单酯化或双酯化Surfactin的制备及脂肽的保存有着重要的参考价值。 本文的研究成果丰富了Surfactin制备、提取和分离的方法,获得了高纯度的样品;提供了一种可以测定Surfactin及其同系物含量的方法,对微生物菌种的筛选、发酵条件的改进和理化性质的测定均具有重要的参考价值;明确了脂肽衍生化反应的特征,为脂肽的结构修饰奠定了基础。
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