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用于拟干酪乳杆菌代谢组学分析的样品处理方法研究和应用

李晓雪  
【摘要】:用气相色谱-质谱联用(Gas Chromatography-Mass Spectrometry, GC-MS)技术建立了用于检测拟干酪乳杆菌胞内代谢物的代谢组学研究方法。考察了不同溶解剂(吡啶、四氢呋喃、甲氧胺盐酸盐)和衍生化试剂(N-甲基叔丁基二甲基硅基三氟乙酰胺、N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰+三甲基氯硅烷和N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺),对质谱峰的信号强度和个数的影响,确定使用吡啶作为溶解剂、N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰+三甲基氯硅烷作为衍生剂的两步衍生法效果最佳。以拟干酪乳杆菌为分析对象,共鉴定出49种胞内中间代谢物。方法学考察结果表明,该方法具有良好的精密度、稳定性和重现性。此外,还采用主成分分析方法对所获得的拟干酪乳杆菌发酵过程胞内代谢产物变化数据进行了代谢模式识别研究。 本文建立了一个用于拟干酪乳杆菌代谢组学研究的样品灭活和萃取方法。使用单元和多元数据分析方法,分析了不同灭活方法(60%甲醇、60%甲醇/0.9%碳酸铵(pH6.0)、60%甲醇/0.9%氯化钠、40%乙醇/0.9%氯化钠和60%甘油/1.35%氯化钠)和萃取方法(100%甲醇,70%甲醇,甲醇/氯仿,乙腈/甲醇/水,连续萃取)作用效果。研究结果表明发现60%甲醇/0.9%氯化钠灭活效率最高并且能够有效降低胞内代谢物渗出,是最适合的灭活方法。此外,建立了连续萃取方法,先使用70%甲醇萃取然后再使用乙腈/甲醇/水萃取,此萃取方法的萃取效率最高且重复性好。 此外,本文将建立的GC-MS分析方法和代谢组学研究的样品处理方法成功用于分析拟干酪乳杆菌发酵生产乳酸过程中的代谢变化。乳酸发酵过程随着发酵进行,菌体进入稳定期后,溶氧往往出现回升现象,同时乳酸产率和得率都有一定程度的下降。采集溶氧(Dissolved Oxygen, DO)回升前后发酵样品进行代谢物组分析,并采用主成分分析法(Principal Component Analysis, PCA)对所获得的代谢物组数据进行模式识别。分析结果表明,发酵过程中伴随着DO回升,大多数胞内代谢物浓度随时间变化发生显著性差异,主要是EMP途径和TCA循环中间代谢物出现大量积累,拟干酪乳杆菌代谢轮廓也呈现出一定规律的变化。因此发酵代谢途径的迁移是造成DO回升后乳酸产率和得率下降的原因。


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