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小分子化合物的添加提高人参皂苷产量及其作用机制探索

黄超  
【摘要】:人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是名贵的药食两用植物,人参皂苷(Ginsenoside)是其主要活性成分之一。由于人参植株生长非常缓慢,采用植物细胞悬浮培养技术生产人参皂苷具有应用前景。但是,植物细胞培养生产人参皂苷的低产问题是限制其大规模应用的主要原因。目前,采用诱导子添加的“信号转导工程”被认为是促进植物细胞次级代谢产物生物合成的一个有效途径,筛选有效的诱导子及研究其对人参细胞培养过程中皂苷合成的调控机理,能够为提高皂苷产量提供重要的理论基础和应用指导。 根据以往的报道,某些重金属盐类无机物,对植物次生代谢产物的合成具有调节作用。在人参体系内,虽然重金属盐,如硫酸铜和硫酸氧钒(Vanadyl,V4+)等,可有效刺激皂苷单体合成,但是对其具体的诱导机制仍缺乏深入了解。另一方面,某些小分子有机化合物也常拥有令人感兴趣的次级代谢诱导效果,据报道,二环己基碳二亚胺(DCCD)能诱导植物的防卫反应和次级代谢,但其能否诱导人参皂苷的合成未见报道。 本学位论文首先考察了不同重金属盐对人参皂苷合成的影响,发现钒酸盐(Vanadate,V5+)能更高效诱导人参细胞的皂苷合成。在此基础上,通过对钒酸盐的诱导浓度和时间的优化,确定了其最佳的条件为在第四天添加50μM。在该诱导条件下,与对照相比,皂苷含量增加了3.4倍,达到499.3±7.0μg/100mgDW。其中单体皂苷Rbl和Rgl和Re的含量分别比对照组增加了10.1、1.5和5.6倍。随后,对钒酸盐促进人参细胞皂苷合成的机理做了进一步探讨。研究发现,在酶分子水平上,钒酸盐显著诱导了人参皂苷合成途径的两个关键酶--UDPG-人参皂苷Rd糖苷转移酶(UGRdGT)和原人参二醇羟化酶(P6H),使它们的酶活性增加,且钒酸盐作用下酶活的增加与相应的皂苷单体含量Rbl和三醇组皂苷(Rgl和Re)的增加是一致的。同时,在基因水平上,钒酸盐添加显著诱导了人参皂苷合成途径中的关键基因鲨烯合成酶(sqs)、鲨烯环氧化酶(se)和原人参二醇合成酶(ds)的转录水平的上调,而环阿屯醇合成酶(cas)的转录水平跟对照组相比无明显变化。为了进一步理解钒酸盐作用下的信号转导机制,本论文考察了钒酸盐对胞内茉莉酸(JA)合成的影响。结果表明,钒酸盐能够有效诱导JA的合成,而JA合成抑制剂能在显著抑制钒酸盐诱导的皂苷含量的增加的同时,抑制了皂苷合成基因转录水平的上调。以上结果说明,钒酸盐能影响皂苷合成基因的转录和酶活的水平,而信号分子JA在该过程中起重要作用。 论文又探索了小分子有机物DCCD对人参皂苷合成的诱导作用。首先优化得到了其最佳的诱导浓度和时间(第四天添加10μM)。在此条件下,皂苷的总含量达到3.4mg/gDW,为对照的3.0倍。同时,皂苷合成酶UGRdGT和P6H的酶活,L-苯丙氨酸解氨酶(PAL)的酶活及皂苷合成关键基因sqs、se和ds的转录水平也得到显著增加。为了了解DCCD促进皂苷合成的机理,本研究从信号转导的角度对其诱导机制做了探讨。结果表明,DCCD诱导显著促进了信号分子一氧化氮(NO)的合成。添加外源NO供体能有效促进皂苷合成,而添加NO合成抑制剂则显著降低了皂苷含量及其合成关键基因转录水平。这些结果表明,DCCD能影响次级代谢产物合成基因的表达,而信号分子NO在其中起到了重要作用。 以上获得的提高人参皂苷产量的诱导子添加策略及其调控机制,为人参皂苷的规模生产并深入理解其生物合成的调控机制,提供了有用信息。同时,本研究也对其他植物细胞次级代谢产物生物合成的发酵过程调控具有一定的参考价值。


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