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《华东理工大学》 2015年
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环氧水解酶BmEH的结构机理与分子改造研究

孔旭东  
【摘要】:环氧水解酶(epoxide hydro lase)能催化水分子立体选择性地加成到环氧底物上,生成相应的邻位二醇。此类水解酶普遍具有较好的位置选择性和对映选择性,因此成为酶法拆分消旋环氧化物制备手性环氧与二醇的理想催化剂。迄今为止已有数百种环氧水解酶的报道,然而天然酶分子所具有的底物专一性导致了环氧水解酶所能作用的底物范围有限,且对于自然界中不存在的非天然底物较难找到高性能的酶。本实验室前人曾从巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) ECU1001中克隆得到一个环氧水解酶(BmEH),它对苯基缩水甘油醚(phenyl glycidyl ether, PGE)具有良好的(R)-对映选择性(E=58)及很高的催化活性(83U mg-1),但对其它可作为β-阻断剂类心血管药物前体的大位阻环氧底物(如萘基缩水甘油醚a-naphtyl glycidyl ether, NGE)的催化活性却下降了上百倍之多,严重限制了其在手性药物合成中的应用。本研究的主要目的是:通过解析酶的结构-功能关系,对酶的反应通道进行结构微调,有效拓展酶催化的底物谱,提高其在药物合成中的应用潜力。 我们首先解析了环氧水解酶BmEH母体的晶体结构(分辨率1.75A)以及酶和底物类似物复合体的晶体结构(分辨率1.95A),并结合定点突变、蛋白质质谱、计算机模拟等手段分析了酶的结构-功能关系,提出了BmEH可能存在相互独立的底物进入和产物释放通道,而催化中心与产物释放位点之间的空间位阻可能限制了酶对大位阻底物的催化活力。通过对活性位点周围氨基酸进行丙氨酸扫描(alanine scanning),我们确定了Met145与Phe128两个位点对BmEH催化PGE及NGE水解的底物专一性起着极其关键的调控作用。突变体M145A和F128A对NGE的比活力分别提高至突变前的26倍和42倍,同时它们对PGE的水解活性却显著下降。通过突变体晶体结构和对酶-底物过渡态中间体形成速率的测定,我们认为中间体形成速率和产物释放速率的增大均是导致突变体活性增加的重要原因。 随后,我们针对Met145与Phe128两个位点分别进行半饱和突变,构建了活性中心空间位阻和疏水性发生改变的BmEH突变体库。对这些突变体进行底物谱分析,测定了突变体对PGE及另外9种可用于合成β-阻断剂的芳基缩水甘油醚的水解活性及选择性。结果表明,与BmEH wild-type相比,BmEH突变体对任一β-阻断剂前体的活性均有显著的提高(6-430倍),并且活性提高的突变体保留了BmEH wild-type的优良对映选择性。动力学分析表明,突变体的催化效率提高多达896倍,且主要贡献来自于kcat的提高。对其中6种底物进行了制备级酶促拆分(1-10g),可获得96.6-99.5%ee及37.3-44.6%收率的(S)-环氧化物。 为进一步体现BmEH突变体在药物合成中的应用潜力,我们对NGE的酶促水解拆分进行了反应优化,并同时制备得到了手性药物普萘洛尔的(S)-和(R)-对映体。以突变体BmEHF128T整细胞作为催化剂,通过优化两相反应的有机相组成及有机相与水相比例,最终选择水/异丙醚/异辛烷=50/35/15(v/v/v)的两相反应体系,底物上载量提高到100gL-1(有机相200g L-1),实现了高底物浓度下对NGE的酶促拆分。在最佳拆分条件下,反应生成(S)-NGE (99%ee)与(R)-3-(1'-naphthyloxy)propane-1,2-diol [(R)-NPD,99.5%ee]的时空产率分别达到136g L-1d-1和139g L-1d-1。从(S)-NGE和(R)-NPD出发,最终以31.4%和44.8%的收率分别合成得到了(R)-和(S)-普萘洛尔(99%ee)。
【学位授予单位】:华东理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:O629.8

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