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《华东理工大学》 2017年
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食源性血管紧张素转化酶抑制肽的抑制机理及体内降血压活性的研究

陈绪军  
【摘要】:血管紧张素转化酶(ACE)是体内血压调节系统的关键酶,也是高血压治疗的药物靶点。食源性生物活性肽是一类来源于食品,副作用小的天然ACE抑制剂。本研究以来源于不同食品——开心果、可口革囊星虫以及小球藻的ACE抑制肽为研究对象,研究了 C-端氨基酸对ACE活性的作用,确定了 ACE抑制肽的抑制类型,并对ACE抑制肽的作用机理从分子模拟和动力学、热力学参数测定等方面进行了阐释,具体内容包括:1.为研究C-端氨基酸对ACE抑制活性的作用,以通过酶解纯化得到的开心果来源ACE抑制肽KAKP(IC50=7.23 μM)为研究对象,通过对C-端氨基酸采用其余七种疏水性氨基酸进行替换、直接删除或与邻位交换等方式获得9条衍生肽,其IC50分布在2.02~6891 μM范围内,活性差距最大约3400倍。其中衍生肽KAKW,IC50为2.02μM,比KAKP活性更强。KAKP和KAKW均为非竞争性抑制剂,且上述两条肽与ACE结合后不被水解。动物实验结果显示KAKP和KAKW在以5 mg/kg体重灌胃自发性高血压大鼠(SHR)后,4 h后收缩压产生最大降幅达50 mmHg。分子对接结果表明KAKP和KAKW都与ACE的活性口袋通过氢键结合,而KAKW形成了更为稳定的结构。通过酶解纯化得到的开心果来源ACE抑制肽RYDF、YASGR和GNGSGYVSR,也是ACE的非竞争性抑制剂,其中GNGSGYVSR与ACE反应4 h可能被ACE水解,水解产物对ACE形成抑制作用。动物实验结果表明GNGSGYVSR可显著降低SHR的血压。2.借助计算机辅助虚拟水解-高效虚拟筛选平台技术获得小球藻来源ACE抑制肽,挑选其中预测活性较高的C-端为Trp多肽,其中两条非竞争性ACE抑制肽,VHW和TTW,IC50分别为0.91μM和0.61 μM。通过分子对接初步揭示了 C-端Trp对ACE抑制活性的作用。动物实验的结果显示,灌胃TTW2h后收缩压达到最大降幅30 mmHg,灌胃VHW 2 h后收缩压达到最大降幅54 mmHg。3.采用亲和层析法分离纯化重组表达的人源ACE,以Lisinopril为配体连接到NHS活化琼脂糖载体上,制成亲和层析柱,ACE纯化倍数达6.1倍,比酶活为2 U/mg,回收率65%。用纯化得到的ACE为实验材料对不同来源的ACE抑制肽的动力学和热力学参数进行了测定。根据热力学参数测定结果,KAKP、KAKW、TTW和VHW与ACE结合反应能够自发进行,是熵驱动的反应。根据亲和常数(KD)为代表的动力学常数测定结果,上述四条多肽与ACE的亲和力较强,能够与ACE形成稳定的复合物结构,反应达到平衡时,其与ACE形成的复合物能够稳定存在。
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