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基于高速离心和去污剂抽提的膜蛋白样品制备方法的建立与优化

周艳婷  
【摘要】:膜蛋白可作为转运蛋白、受体、酶及粘附-锚定蛋白,参与信号转导、亚细胞区室化、膜运输以及蛋白质分泌等生物学过程,并可参与和维持细胞膜的完整结构。目前已知约70%的药物靶标为膜蛋白,因此对膜蛋白的结构与功能研究有助于加快新药设计与研发。然而,由于膜蛋白的疏水性强及丰度低等理化性质使其成为蛋白质组学研究中有待解决的难点。本文建立了能够提高膜蛋白检出率的样品制备方法,通过结合高速离心与去污剂抽提使得样品处理过程相对简便省时,在提高样品制备效率的同时又具有良好的重复性。我们通过液相色谱-质谱联用方法(LC-MS/MS)在分离纯化的膜蛋白组分中鉴定到更高比例的膜蛋白、整合膜蛋白和跨膜蛋白(76.6%、48.1%和40.6%),而总蛋白样品中的对应鉴定率分别为41.6%、16.4%和13.5%。本文建立的方法也利于高疏水性和含多次跨膜区的膜蛋白的鉴定,在膜蛋白组分鉴定到的2106个蛋白质中,GRAVY值0的蛋白质为486个(占23.0%),跨膜区数量≥2的蛋白质为488个(占23.1%);通过对膜蛋白组分和总蛋白样品中共同鉴定到的膜蛋白进行分析,我们发现60.6%的蛋白质在膜蛋白组分中具有更高的序列覆盖率。因此,本文建立了无需依赖超高速离心机设备的膜蛋白样品制备方法,为膜蛋白研究提供了更简便快速的分析手段。


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