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《华东理工大学》 2019年
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基于核酸适配体的外泌体分离检测新方法的研究

高美玲  
【摘要】:外泌体是大多数细胞都会分泌的一种微小囊泡,其直径在30~150 nm之间,携带着其来源细胞的功能核酸、蛋白质等信息,最初它被认为是细胞排泄废物的一种方式,近年来越来越多的研究表明外泌体是细胞间通讯交流的一种载体,与细胞的众多生理学和病理学功能相关,此外,外泌体还参与了肿瘤微环境的形成。因此,外泌体在疾病诊断、治疗及预后过程中发挥着举足轻重的作用。而目前还没有形成规范的、统一的外泌体的分离和检测技术,现存的方法都或多或少存在不同的缺陷,因此,本文针对目前外泌体分离及检测过程中存在的问题,开发了两种外泌体检测的新方法,一种通过双重信号放大技术实现对血清样本中外泌体的高灵敏度检测,另外一种方法创新性的将滚环扩增技术应用于外泌体的分离,实现了外泌体的分离、检测以及蛋白分析一体化操作,为外泌体研究提供了一种新的思路。主要研究内容如下:1、利用双重信号放大技术对肝癌细胞HepG2来源的外泌体进行高灵敏度检测。在这项工作中,我们利用适配体的灵活性设计了一种外泌体定量方法,将外泌体捕获事件转化为核酸检测。利用发夹DNA级联反应(HDCR)和DNA树突状分子自组装实现了双重信号放大。CD63适配体和其封闭探针通过链霉亲和素连接到磁珠上,作为捕获元件。在目标外泌体存在的情况下,适配体识别并与外泌体结合,释放封闭探针作为启动HDCR(第一个信号放大过程)的引发链,打开AuNP(AuNPs)表面固定的发夹DNA(HP1)。荧光标记的DNA树突状大分子与HP1连接作为第二级信号放大,由此提高信噪比。在最优条件下,我们的方法对HepG2细胞来源的外泌体取得了良好的线性响应,线性浓度范围在1.75×1O3~7.0×106粒子/μL,检测极限为1.16×103粒子/μL。另外,我们的方法对生物样品中外泌体的检测也显示出良好的性能。2、构建DNA-AuNP-Exo网络结构实现低离心转速的外泌体分离、检测以及蛋白分析一体化。利用滚环扩增反应(RCA)产生包含多个功能域的长链DNA发夹结构,该长链DNA由多个CD63适配体区、连接区、间隔区组成,由碱基互补配对折叠形成发夹结构。当CD63适配体与外泌体结合后,发夹结构构象改变,暴露出连接区(AuNP结合序列),通过toehold介导的链置换反应,AuNP上的探针与该长链DNA的连接区结合,释放荧光标记的互补探针,产生检测信号,同时形成DNA-AuNP-Exo网络结构,可通过低速离心实现对外泌体的分离。我们通过透射电镜和共聚焦荧光显微镜证实了DNA-AuNP-Exo网络结构的形成。此外,我们建立了荧光比率和外泌体浓度对数的标准曲线,并通过LC/MS对分离的外泌体进行了蛋白谱分析,质谱得到的蛋白质数量和超速离心法得到的蛋白质数量非常接近。
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