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《东华大学》 2011年
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基于Kan~R筛选建立研究Group Ⅰ intron 结构与功能的系统与T erythraeum Ⅱ型内含子归巢机制的研究

殷伟  
【摘要】:Ⅰ型基因内含子和Ⅱ型基因内含子同属于自我剪接型核酶,它们是具有催化活性的RNA分子,能够催化自身从前体RNA中自我剪接并连接其侧翼的外显子从而形成成熟的RNA分子。Ⅰ型基因内含子的二级结构主要包括10个配对区,其自我剪接需要一外源的鸟苷协助,催化是由两个连续的磷酸酯键转移反应完成的。典型的Ⅱ型基因内含子的二级结构由六个茎环结构域以车轮状放射分布组成(结构域Ⅰ-Ⅵ),其中结构域Ⅳ环区包含一个开放阅读框,编码一个多功能的蛋白质。该蛋白质一般具有反转录酶、成熟酶和核酸内切酶三种活性,这些活性对于Ⅱ型基因内含子剪接及其移动性都有着重要的作用。Ⅱ型基因内含子的自我剪接与工型基因内含子的差别在于其自我剪接无需外源的鸟苷协助,而是由其靠近3’端外显子的突起腺苷A所引发。 本论文中的第一部分是在大肠杆菌中建立基于卡那霉素抗性筛选研究Ⅰ型基因内含子结构与功能的系统。Ⅰ型内含子一直是研究RNA结构与功能的理想模型,围绕这类分子实施的碱基突变试验一直是此项研究的主要手段。海洋蓝细菌Nostoc punctiforme的核糖核酸还原酶基因上存在一个Ⅰ型基因内含子,该内含子含有383个碱基,并包含一段新的插入序列,此前研究表明这个内含子在大肠杆菌中能够发生自我剪接反应。本实验室首先将Npu RIR内含子的全部序列插入到pDrive质粒载体的卡那霉素抗性基因中,构建了pKR12质粒。由于该内含子处于异源基因之中并且它的插入并不携带其天然的外显子,所以丧失了固有的剪接活性,含有该质粒的大肠杆菌不能在卡那霉素抗性LB平板上生长。随后我们采用易错PCR对Npu RIR内含子进行定向进化,成功的获得了大量突变内含子,然后构建重组质粒突变库,转化后在含有卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上筛选获得了大量的克隆。经过菌液PCR、酶切等一系列的鉴定排除假阳性以后,初步筛选得到了34个突变的质粒,这些质粒转化进入大肠杆菌以后能够表现出稳定的卡那霉素抗性。实验选取其中的一个突变子pKR12m-3进行RT-PCR鉴定,鉴定结果表明该突变的内含子在卡那霉素抗性基因中具有剪接活性。由此,成功地建立起一个用于实施碱基突变实验来研究1型基因内含子RNA结构与功能的新系统。基于这个系统,具有剪接活性的基因内含子可以很容易的通过KanR筛选而获得,由于intron结构和功能的相关性,进而可以获得与其结构相关的信息。 课题第二部分是在第一部分的基础上进行的延伸,成功构建此系统以后,接着研究Npu RIR内含子的高级结构。实验对Npu RIR内含子的P5环状2581~2585nt处的五个核苷酸GAGAT和P8环状2815-2818nt处的四个核苷酸UUUU分别做了随机突变。随后的抗性平板对照试验表明突变这两个位点的intron失去其剪接活性,因此证明了这两个位点对于Npu RIR内含子的结构是必须的。下一步的实验旨在通过易错PCR方法重新得到具有剪接活性的Npu RIR内含子,据此获得可能与这两个位点发生长距离相互作用的区域信息。但是目前的筛选并没有得到阳性结果,因此未能达到最终目的,因此也无法获得进一步高级结构信息。 课题第三部分初步探索了Trichodesmium erythraeum基因组中Ⅱ型内含子的归巢机制。实验室已经构建了含有Ter dnaN-1内含子序列的供体质粒pDNl-C与含有TerⅡ12(DIDD)内含子序列的供体质粒pDIDD-C。在这两个质粒的的内含子序列中引入KanR基因的开放阅读框。而后又构建了含有Ter dnaN-1和TerⅡ12 (DIDD)内含子的天然插入位点和来自Ⅱ型内含子TerⅡ8(RIR-3)编码的成熟酶的受体质粒pAMl-H2、pAMl-H3,这两个载体携带氯霉素抗性基因。通过电转化构建了含有供体质粒和受体质粒的双质粒菌株,经过诱导表达,Ⅱ型内含子的编码序列有可能从供体质粒上归巢至受体质粒上的天然插入位点上,产生一个新的归巢质粒。此归巢质粒携带受体质粒上的CamR基因和来源于归巢的Ⅱ型内含子上携带的KanR基因,因此转化后有可能通过在含有卡那霉素和氯霉素两种抗生素的LB平板上筛选得出。挑取平板上生长的单菌落,然后在归巢位点的上下游设计引物进行菌液PCR,经过琼脂糖凝胶电泳分析,尚未检测到目的条带。这可能是由于归巢的发生频率较低,不太容易检测到。不过两株含有双质粒的大肠杆菌的成功获得,为进一步深入研究海洋蓝细菌归巢甚至移动性机制提供了前提条件。根据细胞器内共生起源学说,蓝细菌是叶绿体的祖先,在进化生物学上具有重要的意义,因此本课题的研究可以可能为叶绿体的起源和进化提供一些证据。
【学位授予单位】:东华大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q78

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