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分子生态学技术在环境微生物群落与功能基因中的应用研究

肖升木  
【摘要】:随着工业的发展,人类活动对全球环境变化的影响越来越大。当今世界三大环境问题:空气中CO2含量逐渐升高、氮沉积效应和生物多样性下降,都与人类活动有着密切的关系。通过与美国俄克拉荷马大学周集中教授的合作,本文首先通过环境微生物对全球氮沉积问题进行了初步的研究。然后对矿山的环境污染问题--酸性矿山废水中的环境微生物进行了研究。环境样品中微生物的多样性和复杂性,促使人们不断地尝试使用新的研究方法和技术。在本文中,运用分子生态学中的功能基因芯片(functional gene arrays, FGAs)和限制片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)技术对环境微生物群落和功能基因进行了研究。 (1)采用对土壤施加氮肥的方式模拟氮沉积对植物和微生物的影响。从美国明尼苏达大学的Cedar Creek生态科学研究保留地BioCON试验田取得24个样品,12个样品经过施加氮肥的处理,12个样品没有施加氮肥。通过对24个样品的基因组DNA提取和功能基因芯片技术分析后,发现氮肥的施用对土壤中微生物群落结构和植物生长产生了显著的影响。施加氮肥使得采样点的植物地上部分的生物量增加,同时使得植物的地下根部的生物量减少;施加氮肥后,还使得土壤中微生物群落多样性下降。 (2)从百分比上来看,参与碳循环、氮循环、硫循环、磷循环、抗生素、金属抗性、能量代谢和有机物修复的八大类功能基因在施加氮肥和未施加氮肥的样品中百分比相似,没有显著的差异性。从数量上看,八大类功能基因的数量在施加氮肥的样品中比未施加氮肥的样品少。对参与碳循环、氮循环、硫循环和磷循环的功能基因分析后发现,在施加氮肥的样品中参与碳循环、氮循环、硫循环和磷循环的大部分功能基因丰度下降,而且这种差异很显著;同时还对参与氮循环作用的关键功能基因进行了详细地分析。 (3)研究了13个外界因子与24个样品中微生物群落结构之间的关系,发现其中七个外界因子在改变样品的微生物群落结构中可能起到了关键作用。这七个外界因素为:土壤中氮含量(%),土壤C/N比,地上C/N比,土壤中氮含量(g/m2),地上氮含量(g/m2),pH值,和湿度(0-20cm)。对13个外界因子和24个样品的功能基因芯片数据进行了VPA分析,结果表明:"Environmentalfactors"部分能够独立解释样品之间44.37%的差异;"Plant biomass"部分能够独立解释样品之间8.21%的差异;"Environmental factors"和"Plant biomass"的重叠部分能够解释样品之间0.05%的差异;由于土壤样品的复杂性,样品之间的差异还有47.37%不能被解释。 (4)针对BioCON试验田2005年的四个样品和2009年的四个样品,研究了施加氮肥时间长短对土壤微生物群落结构和功能基因的影响。经DCA分析发现不同氮肥施加时间对土壤样品中的微生物群落产生了显著影响,05年样品与09年样品被很好分开。Shannon多样性指数分析、Simpson多样性指数分析和八个样品中检测到的功能基因数目,均说明随着施加氮肥时间的延长,样品中微生物群落的多样性可能呈现上升的趋势。 (5)在05和09年的八个样品中,通过对参与碳、氮、硫和磷循环的功能基因的丰度情况分析,结果表明大部分的参与碳、氮、硫和磷循环的基因在09年的样品中的丰度比05年的样品中的丰度高;但由于t测试得出的P值一般都在0.1以上,说明这种差异不是很显著。 (6)通过RFLP技术对广东云浮硫铁矿的两个酸性矿坑水样品中细菌群落进行了分析,结果表明两个酸性矿山废水样品(G1和G2)中细菌群落结构存在很大的差异;样品G2中细菌的多样性要比样品G1中的细菌多样性大。在两个样品中总共检测到15种细菌,这15种细菌根据系统发育分析结果被归分为4类,即Nitrospira纲,Alphaproteobacteria纲,Betaproteobacteria纲和Gammaproteobacteria纲的细菌。在这两个酸性矿坑水样品中主要存在的细菌是Gammaproteobacteria纲Acidithiobacillus属和Betaproteobacteria纲的细菌。 (7)通过对两个酸性矿山废水样品中得到的单克隆子进行测序、并与网上基因数据库进行比对分析,在样品G1中得到2条未知的细菌16S rDNA基因序列;在样品G2中得到到8条未知的细菌16S rDNA基因序列。这些新的序列,很可能代表着酸性矿山废水中新的微生物。另外,结合两矿山废水样品中细菌群落结构及29个元素含量分析的结果,表明矿山废水样品中元素As、S和Fe的浓度差异可能是形成云浮硫铁矿酸性矿山废水样品中微生物群落结构差异的关键因素。


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