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《东华大学》 2018年
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二代测序平台进行核酸检测的新技术研究

陈科  
【摘要】:核酸检测(nucleic acid test)的对象是脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)和核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)。对于DNA检测,包括DNA序列分析、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)分型、拷贝数变异(copy number variation,CNV)检测、DNA甲基化检测;对于RNA检测,包括基因表达量分析和RNA序列分析。核酸检测已经成为基础生物学、环境科学、临床诊断等众多领域不可或缺的检测技术。近十年来,二代测序快速发展,由于高通量和低成本的优势,该技术已成为核酸检测的重要平台之一。本论文旨在利用二代测序廉价、快速、准确和高通量的优点,进行核酸检测新技术及其延伸应用的研究,以用于SNP分型、目标区段捕获测序和拷贝数变异检测。本论文主要开展了以下个三个方面的研究工作。第一,SNP分型技术的研究。本研究的目的是利用多重PCR灵敏度高、特异性强和操作简便的特点,结合高通量二代测序平台开发SNP分型技术。本研究需要解决两个关键性的技术问题:(1)如何保证样本内的均一性,即保证样本内不同SNP位点的产物具有均一性。因为如果不同SNP位点存在较大扩增偏差,高扩增效率位点的产物会远超低扩增效率位点的产物。在后续测序过程中,高扩增效率位点的产物会占据绝大部分测序通量,导致低扩增效率位点的产物无法得到足够的测序深度去进行准确的SNP分型。(2)如何保证样本间的均一性,即保证浓度差异样本的产物量基本达到一致,以防止高浓度样本占据过高的测序通量,导致测序效率的下降。本研究提出的解决方案:以低浓度特异引物作为PCR产物量的主要限制因素;利用三轮多重PCR将等量的低浓度引物尽可能消耗以保证不同位点和样本的均一性。具体地说:在第一轮多重PCR扩增中,利用低浓度特异引物扩增有限的循环数;在第二轮多重PCR扩增中,将部分第一轮PCR反应体系作为模板添加到第二轮PCR反应体系中进一步扩增,同时不额外添加引物(低浓度特异引物得到进一步稀释),然后进行高循环数扩增以期将特异引物尽可能地消耗产生等量的产物;在第三轮PCR扩增中完成建库。本论文利用三轮多重PCR方案,选取757个人类基因组DNA进行了37个SNP位点的扩增,并在Ion torrent PGM测序仪上对所有扩增子进行测序。测序数据显示,98.6%的扩增子被成功捕获和测序,同时90.4%的扩增子测序深度保持在50倍以内的差异,扩增子的高度均一性保证了二代测序的效率。针对757个样本,98.4%样本的测序深度差异在30倍的范围内。结果表明,三轮多重PCR结合二代测序进行SNP基因分型具有良好的均一性,适合进行大规模样本的SNP基因分型。本论文还进行了利用二代测序数据进行SNP分型判读时的阈值研究。低廉的测序价格和超高的测序通量是三轮多重PCR结合二代测序进行SNP分型的巨大优势,但是在面对海量测序数据时,准确地进行SNP分型仍然是一个不小的挑战。以往的研究经验提出:当测序深度20 X,并且等位基因频率在20%~80%范围内,位点可以判断为杂合子,范围之外的位点为纯合子。这种方案准确、简便和直观,但是该阈值会筛除掉低测序深度位点,导致测序通量的浪费,同时该方案难以判断处于等位基因比率阈值周围的数据。而其他利用二代测序数据进行SNP分型的策略,如千人基因组计划中使用的低深度测序结合连锁不平衡分析的策略,或者利用概率统计等方法的策略也不适合三轮多重PCR结合二代测序进行SNP分型。因此,提出一个准确的、适当的SNP分型阈值,是对三轮多重PCR结合二代测序对大规模样本进行SNP分型时的重要补充。本研究利用PCR-LDR技术对91个样本的19个SNP位点进行检测,将其分型结果与对应的二代测序数据相比较,确定了二代测序数据判定SNP基因型的阈值:当测序深度≥6 X,等位基因比率在15%~85%的位点为杂合子,在范围之外的为纯合子,该阈值准确度达到99.6%;针对等位基因频率分布在阈值边缘的数据,结合聚类分析可将正确率提升至100%。研究结果为利用二代测序数据判定SNP基因型提供了一个准确、快捷和经验性的阈值判读方案。第二,利用新型发夹引物进行目标区段捕获测序。目标区段捕获测序是二代测序的主要应用之一。本研究的目的是通过优化引物设计,研究利用多重PCR进行目标区段捕获的技术。本研究需要解决的关键技术问题:随着引物对数的增加,引物二聚体和非特异扩增产物会急剧增加。引物二聚体和非特异扩增产物不仅会占用测序通量导致测序效率下降和分析困难,而且会导致不同捕获区段差异性增大。本研究提出的解决方案:设计特异发夹引物,提高了引物的特异性。具体地说:新型发夹引物的5’端序列与3’端序列有大约13个碱基互补配对,当发夹引物3’端特异目标区段序列与模板目标区段序列完全一致时(此时配对碱基在20个左右),发夹结构被打开,引物可以进行有效地退火杂交和扩增。否则发夹引物会自身形成茎环结构,从而避免非特异性扩增。本研究比较了传统线性引物与新型发夹引物的扩增特异性,结果显示新型发夹引物能有效地抑制引物二聚体和非特异性扩增。本论文利用新型发夹引物进行44个大鼠样本的89个目标区段扩增,并将所有扩增子在Ion torrent PGM测序仪上进行测序。测序结果显示95.1%的扩增子差异在50倍以内,扩增均一性良好。结果表明了特异发夹引物结合多重PCR技术适合大规模样本的目标区段捕获测序。第三,新型发夹引物的延伸应用:拷贝数变异的检测。CNV与基因功能和人类疾病发生密切相关,因此CNV的研究具有重大的科研价值和临床意义。由于成本低和重复性好,多重荧光竞争性PCR成为检测大量样本多基因或位点CNV的替代技术。但是荧光竞争性PCR面临两个关键性的技术问题:(1)如何建立高效稳定的多重PCR反应体系,以尽可能减少引物二聚体和非特异扩增的影响。(2)如何快速简单地构建一系列多重竞争性PCR内参DNA模板,取代传统依赖于质粒构建或者人工合成的方案。本研究将应用于二代靶向测序的新型发夹引物延伸应用到多重荧光竞争性PCR中,建立一种新型的拷贝数检测方案。提出的解决方案是:利用新型发夹引物的特性进行扩增,克服传统多重PCR技术中非特异性扩增的问题,建立高效稳定的多重PCR体系。同时利用发夹引物进行有限循环数的多重PCR,以构建一系列内参DNA模板。此方案取代了传统的质粒构建或者人工合成,避免了复杂的实验操作和试剂花费。具体地说:第一轮PCR扩增利用新型发夹引物将检测样本和内参样本分别扩增有限的循环数(检测样本引物比内参样本引物多4个碱基,通过长度不同以区分两者产物),扩增后的产物被分别定义为检测文库和内参文库并被等体积混合后纯化。由于扩增有限的循环数,文库间拷贝数的比值与样本间拷贝数的比值一致。第二轮PCR扩增将混合后纯化的文库作为模板,利用荧光引物进行扩增,并将产物直接进行毛细管电泳检测,通过产物长度差异有效地区分检测文库和内参文库并统计和计算两者的荧光比值。基于竞争性PCR原理,通过比较检测文库和内参文库区段之间荧光的比值,结合内参样本内区段的已知拷贝数,即可计算出检测样本内区段的拷贝数。本论文对21个具有潜在基因缺失的样本进行检测,并利用aCGH对多重荧光竞争性PCR检测结果进行验证,结果显示多重竞争性PCR检测结果与aCGH的验证结果完全一致。表明新型发夹引物延伸应用于拷贝数检测是一种准确、低廉和便捷的多位点拷贝数检测的方案。
【学位授予单位】:东华大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q503

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