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《上海应用技术大学》 2016年
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苦荞蛋白对肠道菌群调节作用的研究

路远  
【摘要】:本文以苦荞为研究材料,并以硫酸铵盐沉淀法制备的苦荞蛋白为研究对象。通过体外纯培养测定浊度探究其对乳酸杆菌(植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌)生长和对其胆酸盐耐受能力的影响。再通过体外模拟胃肠道消化与结肠发酵过程,采用菌落计数、荧光定量PCR、PCR-TGGE与气相色谱-质谱联用分析相结合的方法,探究其对肠道中主要菌群(双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌、肠杆菌、产气荚膜梭菌、柔嫩梭菌、拟杆菌)数量、结构、pH及代谢产物短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸及乳酸)的影响。结果如下:(1)在纯培养条件下发酵至32 h时,不同浓度的苦荞蛋白(1、3和5 mg/mL)使植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌培养液的浊度(OD600)分别显著(p0.05)提高12%、26%、35%和15%、27%、31%;同时,苦荞蛋白使植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌在胆酸盐(胆酸钠、甘氨胆酸钠)环境下培养液的浊度分别显著增加了1.6、8.7和4.1、8.3倍,表明苦荞蛋白能促进乳酸杆菌生长且可提高对胆酸盐的耐受作用。(2)在体外模拟结肠环境发酵至32 h时,菌落计数表明高剂量的苦荞蛋白组(HD)使双歧杆菌、乳酸杆菌的数量较空白对照组(CK)分别显著(p0.05)增加了5.9、4.3倍,而使肠球菌、肠杆菌、产气荚膜梭菌的数量较空白对照组分别显著(p0.05)降低了65%、72%、78%。荧光定量PCR的结果也基本一致,还发现HD可使柔嫩梭菌含量从107.10增加到108.15 copies/mL,使拟杆菌含量显著(p0.05)减少了77%。(3)苦荞蛋白可降低肠道pH和显著性地促进短链脂肪酸的产生(p0.05),且HD分别使乙酸、丙酸、丁酸、乳酸显著(p0.05)增加了8.9、33.8、27.3、25.6倍。(4)苦荞蛋白能够增加肠道菌群多样性而且随着苦荞蛋白浓度的增加,其多样性也随之增加,另外,其促进作用显著性高于酪蛋白对照组(p0.05)。苦荞蛋白能够促进乳酸菌等益生菌群的增殖抑制肠球菌等有害菌群的生长,这种抑制作用可能与苦荞蛋白可以提高肠道中短链脂肪酸含量,能够降低肠道环境的pH值有关。因此,苦荞蛋白可能是一种具有类似于益生元作用的功能因子。
【关键词】:苦荞蛋白 胆酸盐 肠道菌群 短链脂肪酸 荧光定量PCR
【学位授予单位】:上海应用技术大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R151;TQ920.1
【目录】:
  • 摘要5-6
  • ABSTRACT6-11
  • 第1章 绪论11-19
  • 1.1 苦荞概述11
  • 1.2 苦荞蛋白的研究现状11-13
  • 1.2.1 苦荞蛋白的组成11
  • 1.2.2 苦荞蛋白的营养价值11-12
  • 1.2.3 苦荞蛋白的生理活性功能12-13
  • 1.3 肠道微生物的研究现状13-17
  • 1.3.1 肠道菌群的组成及特点13-14
  • 1.3.2 肠道菌群的主要代谢产物14
  • 1.3.3 肠道菌群的主要功能14
  • 1.3.4 肠道菌群多样性的分析技术14-17
  • 1.4 本课题研究目的及意义17-19
  • 1.4.1 研究目的17-18
  • 1.4.2 研究意义18-19
  • 第2章 苦荞蛋白对乳酸杆菌生长的影响19-27
  • 2.1 实验材料试剂及仪器19
  • 2.1.1 实验材料19
  • 2.1.2 实验试剂19
  • 2.1.3 实验仪器19
  • 2.2 方法19-20
  • 2.2.1 苦荞蛋白的制备19-20
  • 2.2.2 苦荞蛋白对乳酸杆菌生长的影响20
  • 2.2.3 苦荞蛋白对乳酸杆菌在胆酸盐环境中生长的影响20
  • 2.2.4 数据分析20
  • 2.3 分析与讨论20-26
  • 2.3.1 苦荞蛋白对乳酸杆菌生长的影响20-23
  • 2.3.2 乳酸杆菌胆酸盐耐受性分析23-24
  • 2.3.3 苦荞蛋白对乳酸杆菌耐受胆酸盐的影响24-26
  • 2.4 小结26-27
  • 第3章 苦荞蛋白体外发酵对肠道菌群的影响27-46
  • 3.1 实验材料试剂及仪器27-28
  • 3.1.1 实验材料27
  • 3.1.2 实验试剂27-28
  • 3.1.3 实验仪器28
  • 3.2 方法28-33
  • 3.2.1 实验动物喂养28
  • 3.2.2 苦荞蛋白体外消化实验28-29
  • 3.2.3 体外模型模拟人体发酵过程29
  • 3.2.4 细菌基因组DNA的提取29
  • 3.2.5 传统培养计数的测定29-30
  • 3.2.6 荧光定量PCR的测定30-31
  • 3.2.7 发酵液pH的测定31
  • 3.2.8 短链脂肪酸含量的测定31-33
  • 3.2.9 数据分析33
  • 3.3 分析与讨论33-45
  • 3.3.1 传统培养计数法测定苦荞蛋白对肠道菌群的影响33-38
  • 3.3.2 定量PCR法测定苦荞蛋白对肠道菌群的影响38-42
  • 3.3.3 苦荞蛋白体外发酵对pH变化的影响42
  • 3.3.4 苦荞蛋白体外发酵对短链脂肪酸变化的影响42-45
  • 3.4 本章小结45-46
  • 第4章 PCR-TGGE法测定苦荞蛋白对肠道菌群结构的影响46-53
  • 4.1 实验材料试剂及仪器46-47
  • 4.1.1 实验试剂46-47
  • 4.1.2 实验仪器47
  • 4.2 方法47-49
  • 4.2.1 细菌基因组DNA的提取47
  • 4.2.2 PCR扩增47-48
  • 4.2.3 PCR产物的纯化48
  • 4.2.4 温度梯度凝胶电泳(TGGE)48
  • 4.2.5 TGGE指纹图谱分析48-49
  • 4.2.6 数据分析49
  • 4.3 分析与讨论49-52
  • 4.3.1 PCR扩增产物的分析49
  • 4.3.2 TGGE最佳温度梯度的确定49-50
  • 4.3.3 TGGE图谱分析50-52
  • 4.4 本章小结52-53
  • 第5章 结论与展望53-54
  • 5.1 主要结论53
  • 5.2 研究展望53-54
  • 参考文献54-60
  • 致谢60-61
  • 攻读学位期间所开展的科研项目和发表的学术论文61

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