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重要蔬菜种传检疫性病害检测技术研究

阚春月  
【摘要】:本论文简单介绍了植物种传病害的定义、分类已及其相关检测技术的进展情况。真菌性种传病害的检测方法主要包括洗涤镜检、保湿培养、致病性测定和PCR等方法,植物病毒性病害的检测方法主要有症状观察(包括鉴别寄主反应)、血清学反应、分子生物学方法等。本论文以黄瓜绿斑驳花叶病毒、烟草环斑病毒和黄瓜黑星病菌为例,着重研究植物种传病毒病害和植物种传真菌病害的检测和研究方法,并对种传病害的检测方法作了简单总结。 黄瓜绿斑驳病毒是典型的种传病毒,本研究以接种黄瓜绿斑驳病毒的带毒黄瓜种子作为材料,建立了快速检测黄瓜绿斑驳病毒的多种方法,包括DAS-ELISA法、普通RT-PCR法、荧光RT-PCR法、免疫捕获RT-PCR法和免疫磁珠RT-PCR法,并对各种检测方法的灵敏度进行了比较。结果表明,各种的PCR方法的灵敏度都比DAS-ELISA方法的灵敏度高,其中实时荧光RT-PCR的灵敏度最高,可检测到2ng黄瓜种子中的黄瓜绿斑驳花叶病毒。普通RT-PCR最低可检测到200ng黄瓜种子中的黄瓜绿斑驳花叶病毒,而免疫捕获RT-PCR(IC-RT-PCR)的灵敏度是普通RT-PCR的2倍。免疫磁珠RT-PCR(IMS-RT- PCR)检测时,当磁珠包被的单克隆抗体浓度为1.5×10~(-5)mg/ml时,可检测到的最低的抗原,浓度为7.813×10~(-3)mg/ml,灵敏度是普通RT-PCR的4倍。 烟草环斑病毒是豇豆花叶病毒科,可以通过种子进行传播,本研究通过设计TRSV外壳蛋白的特异性引物,利用实验室现有的TRSV毒源做为试验材料,建立了检测TRSV的普通RT-PCR方法、免疫捕获RT-PCR方法、实时荧光RT-PCR(SYBR Green法)的检测方法,并且对各种检测方法的灵敏度灵进行了研究,确定了不同方法所能检测到的病毒最低含量。 黄瓜黑星病是重要的植物种传真菌病害,是近年来黄瓜生产中的重要病害之一,对我国黄瓜以及其他葫芦科蔬菜和果树生产的造成巨大损失。本研究以黄瓜黑星的三个菌株:菌株-11279、菌株-38730和菌株-沈阳作为实验材料,用PDA培养基进行真菌的培养,在20℃的黑暗和光照两种情况下进行孢子萌发条件的研究,结果表明,在黑暗条件下孢子易萌发。再将三个菌株接种于健康黄瓜叶片上,待黄瓜成熟后取出黄瓜种子,在进行一系列的PCR方法的研究。利用真菌通用引物ITS4/5进行初步筛选,再用特异性引物HGHX-F1/R以及W-F/R和N-F/R进行普通PCR和巢式PCR反应,得出特异性DNA扩增条带和DNA序列。将病菌的孢子形态与病菌的DNA序列结果相结合,从而鉴定出此三种植物真菌是黄瓜黑星病菌。


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