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《上海海洋大学》 2011年
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pH、氨氮胁迫对中国对虾细胞凋亡和抗氧化系统影响机理的研究

王芸  
【摘要】:中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)是我国重要的海水养殖品种,具有适应能力强、生长速度快、耐低温、营养丰富等优点。养殖环境恶化、管理不当等因素引起的环境胁迫所诱导的应激反应,不仅对中国对虾的生理状态及抗病力有显著的影响,甚至严重影响了对虾的养殖成活率。良好的水环境是对虾养殖成败的关键,pH、氨氮是衡量养殖水质质量的重要指标,本文通过研究pH、氨氮胁迫对中国对虾细胞凋亡和抗氧化系统影响,揭示了中国对虾应对pH、氨氮胁迫的应激机理,为对虾抗逆选育和健康养殖提供技术支撑。 研究内容包括以下四个部分: 第一部分,中国对虾细胞凋亡因子Caspase基因cDNA克隆和表达分析。从中国对虾肝胰腺中克隆了Caspase基因,该基因cDNA全长1329b(pGenBank注册号为GU597089),其中开放式阅读框为972bp,包含109bp的5′非编码区(5′-UTR),248bp的3′非编码区(3′-UTR)及一个多腺苷酸信号AATAAA。该基因编码323个氨基酸,预测分子量为36.0kDa,pI为6.27。Caspase编码的氨基酸包含Caspase家族保守的活性位点中心(QACRG五肽)和两个结构域(大亚基p20和小亚基p10),推导的氨基酸不存在信号肽序列。中国对虾Caspase蛋白包含特殊的氨基酸残基His150和Cys198,这两个氨基酸对于催化Caspase酶活性起到至关重要的作用。多序列分析结果表明F. chinensis Caspase与Penaeus monodon Caspase、Fenneropenaeus merguiensis Caspase、Litopenaeus vannamei Caspase-3蛋白质序列同源性分别为83%、82%、76%。 应用荧光定量PCR方法分析了中国对虾暴露于pH7.0和pH9.0水环境中,各组织Caspase基因表达的水平。结果显示:pH7.0组中国对虾血淋巴细胞Caspase基因表达水平12h显著升高,48h达最低,96h达最高值,148h显著低于对照组(P0.05);pH9.0组中国对虾血淋巴细胞Caspase基因表达水平3h显著升高,24h显著低于对照组(P0.05),120h达最大值并显著高于对照组。pH7.0组中国对虾鳃Caspase基因表达水平在48h和120h低于对照组,其余各时间点表达水平均高于对照组,且在148h达最高值;pH9.0组中国对虾鳃Caspase表达水平3h显著低于对照组(P0.05),之后逐渐增加,24h达最高值,48h后随着胁迫时间的延长Caspase基因表达水平逐渐降低。pH7.0组中国对虾肝胰腺Caspase基因表达水平均低于对照组,但3h、48h和96h例外;pH9.0组中国对虾肝胰腺Caspase基因表达水平3h显著增加,之后表达水平逐渐增加,120h达最高值,且在24h至148h期间均显著高于对照组(P0.05)。高、低pH胁迫对中国对虾肌肉Caspase基因表达变化相似,3h略有升高,96h达最高值,148h均显著低于对照组(P0.05)。高、低pH胁迫中国对虾3h后,其淋巴器官Caspase基因表达水平增加,且随着胁迫时间延长,各组Caspase基因表达水平一直处于较高水平。pH7.0组中国对虾胃Caspase基因表达3-12h显著低于对照组(P0.05),之后呈波浪式变化,148h达最高值,与对照组相比差异显著(P0.05);pH9.0组中国对虾胃Caspase基因表达3h显著降低,12-72h表达水平逐渐升高,120h达最高值。 TUNEL分析结果表明中国对虾暴露于pH7.0和pH9.0的水环境中12h,肝胰腺组织开始出现细胞凋亡现象,并且随着胁迫时间的延长肝胰腺细胞凋亡现象越明显,与TUNEL分析中的阳性对照表现相一致。相反pH8.2(对照组)中国对虾肝胰腺没有发现被深染的细胞核,与TUNEL阴性对照组的表现一致。这说明高、低pH胁迫均能够诱导中国对虾肝胰腺组织的细胞凋亡。 第二部分,中国对虾Caspase基因的重组表达、分离纯化和多克隆抗体的制备。克隆中国对虾Caspase基因开放式阅读框序列,构建了该基因原核表达载体pET30a-CAS,通过E. coli稀有密码子分析,将该重组质粒转化入大肠杆菌BL21 (DE) pLysS,成功实现了Caspase基因在E. Coli中的表达。SDS-PAGE分析显示该重组蛋白分子大小约为50 kDa,略大于软件预测的分子量。MALDI-TOF-MS分析验证了该蛋白是中国对虾Caspase蛋白。利用固定金属亲和层析和Co-NTA技术获得的纯化Caspase重组蛋白,免疫新西兰大白兔制备了特异性多克隆抗体,Western blot结果表明中国对虾血淋巴细胞、鳃、肌肉、淋巴器官、心脏、胃和肝胰腺组织中均有Caspase蛋白的表达,但在血清中未检测到特异性的谱带。 第三部分,pH胁迫对中国对虾抗氧化系统及HSP90基因表达的影响。将中国对虾暴露于pH8.2(对照组)、7.0、9.0(胁迫组)的水体中148 h,于胁迫后0、3、12、24、48、72、96、120、148h测定鳃、肝胰腺、肌肉和血淋巴总抗氧化活力(T-AOC)、抗超氧阴离子活力、过氧化氢酶(CAT)活力和CAT、过氧化物还原酶(Prx)和HSP90基因表达的情况。结果显示, pH胁迫12h-24h,对虾各组织T-AOC、抗超氧阴离子、CAT酶活力及CAT基因表达均增加,pH胁迫120h-148h上述指标受到抑制。对虾肝胰腺和肌肉Prx基因表达随胁迫时间增加逐渐升高,鳃和血淋巴Prx基因表达随胁迫时间增加呈下降趋势。高pH(9.0)胁迫时,对虾鳃抗氧化系统酶活力及基因表达水平达峰时间较其他3个组织明显缩短;而低pH(7.0)胁迫时,对虾肝胰腺抗氧化系统酶活力比其他组织变化快。高pH(9.0)组中国对虾肝胰腺HSP90基因表达显著高于对照组(P0.05),肌肉组织HSP90基因表达除72h外均显著低于对照组(P0.05)。试验结果表明,pH胁迫3h-24h对中国对虾抗氧化系统酶活力及相关基因表达有一定的诱导效果,但胁迫120h-148h则抑制其抗氧化系统功能,可能会导致中国对虾机体的氧化损伤;中国对虾鳃和肝胰腺分别对高、低pH胁迫较敏感。 第四部分,氨氮胁迫对中国对虾抗氧化系统、血淋巴氨氮成分及HSP90基因表达的影响。将中国对虾暴露于不同氨氮浓度(0mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L)的水体中96h,于胁迫后0、6、24、48、72、96h测定中国对虾血淋巴氨氮、尿素氮浓度和鳃、肝胰腺、肌肉和血淋巴的T-AOC、抗超氧阴离子、Na~+ K~+-ATPase、Ca~(2+) Mg~(2+)-ATPase活性及CAT、Prx、Caspase、HSP90基因表达水平,结果显示:(1)当水体氨氮浓度从0.220mg/L到13.449mg/L时,中国对虾血淋巴氨氮浓度明显升高,于24h-28h达最低值,72-96h达最高值,但均显著高于对照组(P0.05)。(2)当水体氨氮浓度从0.220mg/L到9.446mg/L时:中国对虾血淋巴尿素氮含量明显升高且显著高于对照组(P0.05),各组尿素氮浓度6h达最高值;中国对虾鳃、肝胰腺和肌肉Na~+ K~+-ATPase、Ca~(2+) Mg~(2+)-ATPase活性及HSP90基因表达水平明显升高,并且各指标变化基本一致。当水体氨氮浓度从9.446mg/L到13.449mg/L时,血淋巴尿素氮浓度和鳃、肝胰腺、肌肉Na~+ K~+-ATPase、Ca~(2+) Mg~(2+)-ATPase活性及HSP90基因表达水平明显降低,说明高氨氮浓度抑制血淋巴尿素氮的合成、ATPase活性及HSP90基因表达水平(3)当水体氨氮浓度从0.303mg/L到8.625mg/L时,中国对虾T-AOC、抗超氧阴离子活力及CAT基因表达水平升高,并在胁迫后6h或96h达最高值;Prx基因表达水平均在72-96h达最高值。当水体氨氮浓度大于8.625mg/L时中国对虾的抗氧化系统受到抑制。(4)Caspase基因表达水平均在氨氮胁迫后的72-96h达最高值(实验后期),该表达变化与pH胁迫后Caspase基因的表达变化相似。推测高浓度氨氮能够诱导中国对虾Caspase基因的表达,进而诱导中国对虾的细胞凋亡。
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S917.4

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6 李娜;赵云龙;;水环境中的铜对罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)肝胰腺细胞超微结构的影响[A];中国动物学会甲壳动物学分会、中国海洋与湖沼学会甲壳动物学分会2004年甲壳动物学分会会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2004年
7 陈立侨;江洪波;周忠良;艾春香;;中华绒螯蟹幼体肝胰腺超微结构的研究[A];第七届全国海洋湖沼青年学者学术研讨会论文摘要集[C];2000年
8 李娜;赵云龙;;水环境中的铜对罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)肝胰腺消化酶活性的影响[A];中国动物学会甲壳动物学分会、中国海洋与湖沼学会甲壳动物学分会2004年甲壳动物学分会会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2004年
9 ;A Novel Class of Caspase-3 Inhibitors:Tetra- and Pentasubstituted Dihydropyrroles Prepared by Multicomponent Reactions[A];2011年全国药物化学学术会议——药物的源头创新论文摘要集[C];2011年
10 刘智俊;陈浩;吴旭干;成永旭;杨筱珍;;三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)卵巢发育过程中肝胰腺与卵巢中17-β雌二醇和17-α羟基孕酮受体的免疫组化定位[A];中国甲壳动物学会第十一届年会暨学术研讨会论文摘要集[C];2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 环境保护部华东环境保护督查中心 朱风松;如何有效减排氨氮?[N];中国环境报;2011年
2 一帆;caspase—8缺陷导致免疫紊乱[N];医药经济报;2002年
3 本报记者 周雁凌 季英德;山东挂牌督办二十八件突出问题[N];中国环境报;2009年
4 崔明华 马梅;五大工程完成投资20亿元[N];中国环境报;2009年
5 河北远征药业股份有限公司 段晓燕;斑节对虾杆状病毒病[N];中国畜牧水产报;2001年
6 无锡市水产站;判断鱼死亡原因的简易方法[N];江苏农业科技报;2011年
7 记者 李海英 见习记者 吕晴;今年以来沈阳有197个“好天”[N];沈阳日报;2011年
8 广东省水产技术推广总站 陈文 彭华林;对虾的病害防治[N];中国海洋报;2001年
9 苏丽娜 记者 宋健;焦作市力促发展与环保相协调[N];人民政协报;2008年
10 恒子;控制IGF-1的相互作用有望治疗心力衰竭[N];中国高新技术产业导报;2001年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王芸;pH、氨氮胁迫对中国对虾细胞凋亡和抗氧化系统影响机理的研究[D];上海海洋大学;2011年
2 蒋惠;中华绒螯蟹的基因表达谱及生殖相关基因的克隆、表达模式研究[D];华东师范大学;2011年
3 徐景涛;典型湿地植物对氨氮、有机污染物的耐受性及其机理研究[D];山东大学;2012年
4 曾辉平;含高浓度铁锰及氨氮的地下水生物净化效能与工程应用研究[D];哈尔滨工业大学;2010年
5 曾辉平;含高浓度铁锰及氨氮的地下水生物净化效能与工程应用研究[D];哈尔滨工业大学;2010年
6 徐华;Caspase-3蛋白在重离子辐照肺癌细胞中的功能研究[D];兰州大学;2012年
7 李翔;P21活化蛋白激酶2抑制化疗药物诱导的人乳腺癌细胞凋亡的机制研究[D];郑州大学;2012年
8 于洋;北运河水体中氨氮的氧化过程及微生物响应特征[D];首都师范大学;2012年
9 郜卫华;长期低盐胁迫诱导凡纳滨对虾肝胰腺差异表达基因的分析和鉴定[D];中国海洋大学;2012年
10 王凌;caspase途径在丁酸钠诱导结肠癌细胞凋亡中的作用及调控[D];武汉大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈金凤;氨氮对文蛤能量收支的影响及其毒理效应的研究[D];苏州大学;2010年
2 邹磊;实验性大鼠脑出血后脑水肿周围NF-κB和Caspase-3的表达及相互关系[D];中国医科大学;2010年
3 张释双;粒细胞集落刺激因子对大鼠脑缺血再灌注损伤Caspase-3与细胞色素C含量的影响[D];山西医科大学;2011年
4 宋光年;中国明对虾凋亡基因caspase的克隆、表达及功能的初步分析[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2010年
5 常彬;OA患者关节软骨细胞Caspase-8基因启动子区非甲基化水平与蛋白表达的相关性研究[D];中南大学;2010年
6 白丹;EPO对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤时脑组织Caspase-9和Caspase-3的影响[D];山西医科大学;2011年
7 刘海洋;气态膜吸收法处理丙烯腈废水中的氰化物和氨氮[D];湖南大学;2010年
8 余敏;1-磷酸鞘氨醇、Caspase广谱抑制剂和干细胞因子对小鼠早期胚胎发育的影响[D];南方医科大学;2010年
9 苏玉慧;耐力运动对不同月龄ICR小鼠肝脏mtDNA氧化损伤及Caspase依赖的细胞凋亡的影响[D];华东师范大学;2011年
10 张元隆;Caspase 3和Caspase 8与蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的关系[D];福建医科大学;2011年
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