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基于线粒体COI基因和微卫星标记对细鳞鲴种群遗传结构的研究

张勇  
【摘要】:细鳞鲴(Xenocypris microlepis)隶属于鲤形目,鲤科,鲴属,在我国大多数江河湖泊中均有分布。本论文通过对基因组DNA进行扩增得到细鳞鲴线粒体细胞色素c氧化酶亚基I(Cytochrome oxidase subunit I,COI)基因序列全长,然后利用COI基因部分序列作为标记对钱塘江和曹娥江流域的细鳞鲴群体的遗传结构进行了初步的探讨,最后用ISSR—抑制PCR法筛选细鳞鲴微卫星位点,并用筛选出的微卫星位点对细鳞鲴群体进行了遗传多样性和遗传结构的分析,从分子水平上探讨了钱塘江和曹娥江的细鳞鲴群体间的遗传关系。 1、细鳞鲴线粒体COI基因序列测定与分析 首先根据GenBank数据库中几种鲴属鱼类的线粒体COI基因两端保守的tRNA序列区设计简并引物对基因组DNA进行扩增,PCR扩增产物纯化后测序,最后获得了COI基因1551bp大小的序列全长,起始密码子为GTG,终止密码子为TAA。通过BLAST进行同源性分析比对结果显示:细鳞鲴的线粒体COI基因与银鲴,黄尾鲴和圆吻鲴三种鲴属鱼类线粒体COI基因序列相似度分别为94%、94%和92%,具有较高的同源性。通过MEGA4.0进行遗传变异分析,并根据遗传距离构建系统发育树,四种鲴属鱼类的系统发育进化树采用邻接法(Neighbor-Joining,NJ),以青鱼的线粒体COI基因序列为外类群,基于Kimura双参数模型进行构建,系统发育树构建结果显示:银鲴和黄尾鲴聚为一支,然后与细鳞鲴聚为一支,而与圆吻鲴的关系相对较远。 2、利用线粒体COI基因标记探讨细鳞鲴群体遗传结构 根据获得的COI基因序列全长,用Primer Primier 5.0软件在变异较大的区域设计引物扩增部分COI,设计的引物产物片段大小为560bp,上游引物位于COI基因510bp处,下游引物位于1070bp处。对钱塘江和曹娥江两流域七个地点的细鳞鲴群体131个样本基因组进行扩增后,PCR扩增产物纯化后直接进行双向测序,以增强测序结果的可靠性。将获得的序列片段用于遗传多样性和遗传结构分析,分析结果显示:七群体的单倍型多样性(h)分别为0.5000、0、0.1425、0.1287、0.3556、0.5330和0.1732,核苷酸多样性(π)分别为0.0009、0、0.0002、0.0002、0.0006、0.0010和0.0003,其中FS群体的多样性水平最高,另外六个群体多样性水平都较低;七个群体COI基因片段序列的A、T、G、C含量具有一定的偏倚性,A+T含量明显高于G+C含量;共有3个变异位点,分别发生在第45、264和395三个位点,产生4个单倍型,分别为hap1(FK1)、hap2(FK7)、hap3(LQ12)和hap4(FW26)。其中,除了JJZ只有一种单倍型外,其余六个群体都有两个单倍型。对所有单倍型做最小拓展网络(minimum spanning network)分析表明,FK1是最主要、最原始的单倍型,其他的单倍型为拓展单倍型;AMOVA分析显示,群体间遗传变异占总变异的13%,群体内的遗传变异占总变异的87%,表明群体内变异是总变异的主要来源。 3、细鳞鲴微卫星的筛选及多样性鉴定 ISSR—抑制PCR法是一种简便快速的筛选微卫星位点的方法,它与常规的微卫星位点筛选的方法不同,不需要富集文库,由此节省了大量时间和花费。ISSR—抑制PCR法筛选微卫星是利用ISSR片段两端均含有SSR片段,从而有较强的针对性,对于缺乏引物序列信息的物种而言,是一条简便有效的途径。本实验利用此法设计了14对微卫星引物XI1~XI14,最终有5个位点具有多态性,分别为XI2、XI5、XI7、XI11和XI13,表明此法运用于鱼类微卫星标记的筛选是可行的。将5个位点的扩增统计结果用PopGen32软件进行计算分析,位点X13具有较高的观测杂合度和期望杂合度,分别为0.6559和0.7402;位点X11的观测杂合度和期望杂合度较低,分别为0.1398和0.1307。哈迪温伯格检验结果表明均不显著(P0.05),没有偏离哈迪温伯格平衡,不存在杂合子过剩状态,可以作为良好的微卫星标记。通过软件计算群体间Nei’s遗传距离和遗传一致性,每两个群体间的遗传一致性都趋近于1,说明群体间无明显分化;遗传距离在0.0500~0.1910之间,根据遗传距离通过UPGMA法构建系统树,FK、JJZ、LQ和FW四个群体聚为一支,SY和SD两个群体聚为一支,FS群体的距离相对较远,部分符合地理上的距离关系。


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