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《上海海洋大学》 2011年
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抑制差减杂交法构建鳙鱼染毒微囊藻毒素-LR后差异表达基因文库及相关基因表达分析

崔志辉  
【摘要】:随着淡水水体富营养化日趋严重,藻类水华所造成的水污染问题也引起了人们越来越多的关注,目前已知产毒最多、对动植物体以及人类健康危害最大的当属有毒蓝藻。其中微囊藻毒素就是有毒蓝藻产生的多种毒素的一种。根据结构的差异,微囊藻毒素又分为很多类型。本研究选择了有毒蓝藻水华中分布最广、浓度最大、致毒最严重的微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR,MC-LR)来进行试验。MC-LR可影响鱼类的胚胎发育和生长,也可引起肝脏、肾脏等多器官的病理变化,导致鱼体的氧化损伤等。 尽管人们普遍认为,MC-LR进入生物体内后,主要是在谷胱甘肽S-转移酶的催化下与谷胱甘肽发生加合反应,从而使得其毒性降低;另外针对MC-LR产生的氧化损伤生物体也会启动抗氧化应激反应。之前的研究多从病理变化和生物体生理生化指标的变化来探究MC-LR的降解反应原理以及生物体抗MC-LR的机理,但是有关MC-LR对鳙鱼整体分子水平上的毒性影响以及诱导鳙鱼差异表达的功能基因上的研究以及相关解毒基因转录调控机制则相对较少。本研究采用腹腔染毒方式(200 g/kg,BW),使得MC-LR快速、直接地作用于肝脏,结合semi-quantitative RT-PCR技术,并利用MC-LR毒性响应标志基因GST作指示,来确定鳙鱼染毒后响应MC-LR毒性反应的最早启动时间,为下一步构建差减文库的选样做理论支持。从结果来看,鳙鱼注射MC-LR后,在0.5h即启动了响应,并且GST的表达量与对照组相比,有显著下降。故此,差减杂交文库的构建选用了染毒后0.5h的对照组和染毒组肝脏组织作为初始材料。根据抑制差减杂交技术原理的特点,正向差减文库采用对照组肝细胞mRNA转录的cDNA作为tester,染毒组得到的cDNA作为driver,构建了MC-LR诱导鳙鱼差异表达基因的正向文库;而反向差减文库则与之相反,采用染毒组肝细胞mRNA反转录得到的cDNA作为tester,对照组得到的cDNA作为driver,构建了MC-LR抑制鳙鱼表达基因的反向文库。通过构建的正、反两个差减cDNA文库,本研究筛选到了涉及细胞凋亡、细胞骨架构建、基因转录、信号传导和细胞代谢等多个方面的功能基因。这些基因在降低MC-LR毒性、使机体免受损伤过程中扮演了重要角色。正、反向文库中都筛选到了多个免疫系统相关基因,但又不尽相同,各组分负责了免疫毒性方面的不同功能,另外,有的是诱导表达,有的是被抑制表达。正库当中的乳酸脱氢酶基因、热激蛋白70基因对于鳙鱼抗氧化反应中起到了重要的作用,尤其是热激蛋白70表达量的上调会使得鳙鱼更能够对微MC-LR产生耐受;而丝氨酸/半胱氨酸磷酸酶基因的出现更是说 明了MC-LR通过抑制细胞内的磷酸化反应作为主要的致毒方式。在反库中差异表达的p53和原癌基因c-myc都是与细胞凋亡及肿瘤发生密切相关的。 通过对正向差减文库、反向差减文库中挑选的差异表达基因作不同染毒时间的半定量表达分析可以看出,与对照组相比,正库中Fs309、Fs314的表达量都有显著升高;而反库中的Rs204和Rs252在不同染毒时间组的表达水平都出现了显著下调,这说明此次试验构建的差减cDNA文库非常成功。而值得注意的是,Fs314所代表的细胞色素P450基因表达量的显著升高,说明其对于MC-LR的敏感性可能比谷胱甘肽S-转移酶基因还要高,可以考虑被作为指示响应MC-LR毒性反应的候选基因。
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q78

【参考文献】
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