海洋溶藻细菌的筛选及其溶藻特性研究

【摘要】：由于水体富营养化等原因导致的赤潮灾害对水生生态系统、水产养殖产业和人类健康造成严重影响，已经成为全球性的环境问题之一。在利用物理、化学方法治理不甚理想的情况下，生物方法因其高效快速、经济实用且无二次污染的特点，逐步引起人们的关注。有研究发现，赤潮爆发水域中很多细菌对赤潮藻类具有显著的抑制和杀灭效果，表明利用溶藻细菌治理赤潮是可行的。利用溶藻细菌抑制或防治赤潮藻类具有高效快速、安全可靠，对环境负面影响小的优点，已经成为国内外赤潮防治研究的热点。本研究从深圳东部大鹏湾赤潮爆发海域的表层海水和沉积物中筛选出对锥状斯氏藻（Scrippsiella trochoidea）、海洋原甲藻（Prorocentrum micans）、中肋骨条藻（Skeletonema costatum）和三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）具有溶藻效果的海洋细菌，利用48孔细胞培养板及液相感染法研究了溶藻细菌的溶藻效果和溶藻作用方式，旨在为海洋细菌控藻及赤潮生物防治技术的开发提供基础资料。主要研究结果如下： 1.本研究筛选出的11株海洋溶藻细菌中，5株编号为N3、N5、N10、N21和N29的细菌能使锥状斯氏藻细胞变形，细胞膜内物质分布不均匀并失去运动活性而聚集沉淀，最终死亡。此5株细菌对锥状斯氏藻的溶解作用具有浓度依赖性，2%浓度的处理组溶藻效果最好，5株溶藻细菌至120h时可消除90%-100%的藻细胞。其次为处理组（1%），其中除N3和N10组的藻细胞呈上升趋势外，N5、N21和N29至120h的藻细胞死亡率可达95%-100%。而处理组（0.1%）均无显著的溶藻效果。各溶藻细菌与藻液混合后，细菌N3的密度总体上明显下降，而N5、 N10、N21和N29的细菌密度均呈波动下降趋势。5株溶藻细菌中，菌株N3、N5、N10和N29的溶藻方式为直接溶藻，其中，N29的代谢产物中的蛋白或多肽类物质变性后具有抑制藻细胞生长的活性，而菌株N21的作用方式为间接溶藻，且分泌的溶藻物质具耐105℃高温的性质，可能为非蛋白或多肽类质物质。 2.4株编号为N3、N5、N10和N29的细菌使海洋原甲藻细胞膨胀成椭圆球形，膜内物质聚集一端并失去运动活性，最终死亡。这4株细菌对海洋原甲藻的溶藻作用具有浓度依赖性，总体上处理组（10%）的溶藻效果最好，至120h时除N3组仅消除78%的藻细胞外，其余各菌株使藻细胞的死亡率达97%-100%。其次为处理组（5%），4株细菌使藻细胞的死亡率达70%-85%，而处理组（1%）均都无显著的溶藻效果。溶藻细菌与藻液混合后，菌株N5和N10的细菌密度显著下降，而N3和N29的细菌密度呈波动变化。4株溶藻细菌中，菌株N3、N5和N10的溶藻方式均为直接溶藻，其中，N3和N5的代谢产物中的非蛋白或多肽类物质具有抑制藻细胞生长的活性，而菌株N29的溶藻作用方式为间接溶藻，且分泌的溶藻物质具耐105℃高温的性质，可能为非蛋白或多肽类质物质。 3.4株对中肋骨条藻具有溶解作用的细菌编号分别为P1、P5、N5和N21，其中，细菌P1、N5和N21使条链状排列的藻细胞断裂成单个细胞，然后单个细胞膨胀成圆球形并最终破裂死亡，而菌株P5使藻细胞直接裂解死亡。溶藻效应研究中，总体上处理组（10%）的溶藻效果最好，在120h内除P1仅消除99%的藻细胞外，其余细菌均使藻细胞全部死亡。其次为处理组（5%），除菌株P1在120h仅消除73%的藻细胞外，其余细菌使藻细胞全部死亡。而处理组（1%）则没有明显的溶藻效果。溶藻细菌接种到藻液中后。菌株P1的密度在24h内迅速下降后小幅波动变化；N21和P5的细菌密度均为先升高后呈下降趋势；而细菌P5的密度为波动变化。4株溶藻细菌中，菌株P5、N5和N21的溶藻方式为直接溶藻，且此3株细菌的代谢产物具有抑制藻细胞生长的活性，而菌株P1的溶藻方式为间接溶藻，且分泌的溶藻物质在105℃高温后不再具有溶藻活性，具热不稳定性，可能为蛋白或多肽类质物质。 4.本实验筛选出的对三角褐指藻具有溶解作用的编号分别为P4、P14、N4和N15的细菌均使藻细胞变形并聚集沉淀死亡。溶藻效应研究中，总体上处理组（10%）的溶藻效果最好，至120h除菌株P4仅消除10%的藻细胞外，其余菌株均使藻细胞全部死亡。其次为处理组（5%），至120h除菌株P4和P14分别消除42%和78%的藻细胞外，菌株N4和N15可全部消除藻细胞。而处理组（1%）则没有明显溶藻效果。溶藻细菌与三角褐指藻混合后，P4的细菌密度先明显升高后下降，而P14、N4和N15整体上呈波动变化。4株溶藻细菌中，菌株P4、P14和N15的溶藻方式均为直接溶藻，且菌株P4的代谢产物经105℃高温后具有抑制藻细胞生长的活性。而N4为间接溶藻，且分泌的溶藻物质具耐105℃高温的性质，可能为非蛋白或多肽类质物质。 5.通过16S rRNA序列分析，结合细菌形态观察和生理生化特征鉴定，基本确定筛选出的11株溶藻细菌中，菌株N3、N4、 N15、N29和P1均属于芽孢杆菌科（Bacillaceae），其中，N3、N4和N29为芽孢杆菌属（Bacillus sp.），而N15和P1则隶属于Halobacillus sp.；菌株N5属于γ-变形菌纲（γ-proteobacteriacea）的Kangiella sp.；N10、P5和N21同属于拟杆菌门（Bacteroidetes），其中，N10和P5隶属于黄杆菌科（Flavobacteriaceae）的Muricauda sp.，而菌株N21隶属于火色杆菌科（Flammeovirgaceae）的Roseivirga sp.；菌株P4和P14分别属于放线菌门（Actinobacteria）的微球菌属（Micrococcus）和Aeromicrobium sp.。