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《上海海洋大学》 2012年
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草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株VP5蛋白的功能及免疫原性分析

王杭军  
【摘要】:草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国淡水主要养殖品种,是“四大家鱼”之一。其饲养成本低,养殖范围广,但养殖过程病害较多,其中草鱼出血病可引起草鱼大批死亡,草鱼种苗阶段受感染的死亡率高达90%,给养殖生产带来了巨大的损失。引起草鱼病毒性出血病的病毒为草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV),隶属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)、水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus,AQRV)。根据本实验室已获得的草鱼呼肠孤病毒广东株GCRV-GD108株全序列,本研究对其编码VP5蛋白的M5基因序列进行了分析,同时构建其原核表达载体,制备重组VP5蛋白,检测了其NTPase(核苷三磷酸酶,nucleoside triphosphatases)活性,并对其免疫原性进行了初步研究。 1.草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株M5基因序列分析 GCRV-GD108的M5基因全长2230bp,含一个开放阅读框(ORF)2178bp。Blast结果显示M5基因编码分子量大小约80ku的蛋白。氨基酸序列分析表明,该蛋白与水生呼肠孤病毒属中多个病毒株的核衣壳蛋白VP5的氨基酸同源性为24%-25%;与哺乳动物正呼肠孤病毒(Mammalian reovirus,MRV)的μ2及禽呼肠孤病毒(Avianreovirus,ARV)的MμA也有较高的同源性(20%)。且该蛋白包含一段μ2样NTP结合保守区域,因此可确定GCRV-GD108株M5基因编码的蛋白为VP5,与MRV的μ2和ARV的μA蛋白同源。 2. GCRV-GD108株M5基因原核表达载体的构建及表达 以根据已获得的M5基因cDNA序列,分别设计合成带特定酶切位点的特异引物,进行PCR扩增;通过酶切与连接,构建了两种重组表达载体pET30c-M5和pColdⅡ-M5,分别转化于大肠杆菌并进行诱导表达;对培养基、诱导时间、诱导剂浓度和温度等条件进行优化,确定最适表达体系。SDS-PAGE和Western Blot对表达产物进行鉴定。结果显示所构建的两种VP5蛋白原核表达载体,均在大肠杆菌中成功地表达了分子量大小与预期相符(约为80ku)的重组蛋白,且表达产物主要存在于包涵体中。诱导表达后的菌体经离心、洗涤与超声破碎,离心收集包涵体。包涵体通过变性、透析与复性,获得纯化的重组蛋白,其中pET30c-M5/BL21(DE3)工程菌的目的蛋白占全菌蛋白的22.5%,纯化后获得了高纯度的重组蛋白(95%)。比较两种表达载体的表达结果,认为表达载体pET30c-M5具有诱导表达耗时少、获得重组蛋白量大的优势,可为下一步的研究提供足量的蛋白。 3.重组GCRV-GD108株VP5蛋白NTPase活性及免疫原性分析 重组蛋白经纯化后,进行ATPase活性测定,通过钼酸铵比色法分析显示重组VP5蛋白具有一定的ATPase活性,活力为0.693μmolPi/mgprot/hour。同时用重组蛋白免疫草鱼,采用荧光定量PCR方法分析诱导前后草鱼头肾组织IgM基因表达水平的变化,结果显示免疫组IgM mRNA的水平均高于对照组。Elisa分析VP5蛋白诱导产生的抗体效价,结果显示呈现阳性反应,说明重组蛋白能诱导产生特异性抗体。但对草鱼的保护性实验结果显示,免疫组几乎没有保护效果。本研究结果说明VP5应可在病毒内部RNA转录过程起作用,同时该蛋白具有免疫原性,但诱导产生的抗体未能为草鱼提供抗病毒保护。
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S943

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