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我国七处移植公鱼线粒体COI条形码的物种鉴定、遗传结构分析及西太公鱼微卫星开发

吴颖  
【摘要】:一、我国主要移植公鱼种类的鉴定 公鱼原产于日本北海道等地区,随着移植,公鱼产业从80年代开始在我国兴起,发展前景十分广阔。自我国公鱼行业新兴以来,许多学者从养殖学、生态学等角度对它进行了研究。然而,由于公鱼属各个不同种的鱼类形态差别小,多数学者将我国现有的公鱼作为池沼公鱼(Hypomesus olidus Pallas)开展各项研究。2009年,曹晓霞,董仕等对天津于桥水库和北京密云水库的公鱼从形态学上进行了物种鉴定,所采用的实验手段是外部测量及解剖观察,结果表明这两个地点所移植的公鱼是西太公鱼(Hypomesus nipponensis McAllister)。结合这些学者的研究,本研究采用分子手段,进一步鉴定在我国进行大量移植并取得一定成效的公鱼所属的种类。 本研究通过线粒体COI基因序列的DNA条形码的方法,对在黑龙江以及新疆各个地区所采集的47尾公鱼作出了物种鉴定。经过参考Genbank上已有的数据,分析各种群之间的遗传距离,在DNA barcoding鉴定中心的条形码网站BOLDSystems进行序列比对以及系统树的构建,得出结果:公鱼核苷酸碱基的偏倚性不明显,48个个体分为18种单倍型,单倍型的共享个体数最大为22个。48个样本的COI序列与Genbank中西太公鱼的序列最为接近,且遗传距离在0.01以下;而与池沼公鱼的序列相差较大,遗传距离在0.1以上,相差大于10倍。在系统树中,48个样本与西太公鱼序列在节点处聚集,支持率大于90%。因此,在我国新疆及黑龙江地区大量移植的公鱼是西太公鱼。 二、用线粒体控制区的手段研究公鱼群体遗传结构 线粒体DNA是一种分子标记,它目前已经在系统学研究领域中得以广泛应用。 线粒体控制区(即D-loop)为非编码区,它不编码蛋白质,受到的选择压力也相对较小,由此在其中积累了相对多的基因突变,比如碱基替换,插入缺失,以及串联重复序列等。 在各种生物学研究中,迄今为止已有了相当数量的线粒体控制区研究成果,也有众多的保守序列被识别,同时线粒体控制区在系统发育分析中应用的报道也正在不断增加。 本实验分析了48个公鱼个体的线粒体控制区序列,发现48个个体分为37个单倍型,很少有共享单倍型,个采样点的单倍型无明显规律,显示了个体之间无明显的系统地理谱系关系。通过核苷酸多态性分析,福海水库群体遗传多样性最高;根据成对遗传分化指数分析,出黑龙江镜泊湖与二连洼地、云南柴河水库群体间具有显著性差异之外,其他各群体间均无显著差异。 三、我国移植公鱼种类微卫星标记的筛选 微卫星标记(Microsatellite),又称简单重复序列(Simple Sequence Repeat,SSR),它均匀分布于基因组中,遵循孟德尔分离定律,多态性丰富,呈现共显性遗传,并易于PCR扩增,目前此方法已被广泛应用于各种家系分析、基因连锁分析等许多领域,FAO也已将它列为动物遗传学研究的首选标记(http://www.fao.org/docrep/012/i0283c/i0283c.pdf)。 本实验运用磁珠富集的方法对西太公鱼的微卫星分子标记进行了筛选,实验共获得391个重组子,其中132个成功插入了公鱼基因组的克隆片段,其中114个汗微卫星序列。实验选择重复单元较长的序列,经过去载体处理后,设计了30对引物并用丙烯酰胺凝胶电泳检测。检测得到10对符合条件,有多态性的微卫星标记,并用这些标记对黑龙江镜泊湖的群体(24个个体)进行了多态性的验证。结果显示,各位点有效等位基因数为5-16,均值为8.8,PIC平均值为0.7209,观察杂合度为0.8100,期望杂合度为0.7666。在此10对引物中,有两对偏离了哈代-温伯格平衡(P0.05)。这些微卫星分子标记可在将来应用于公鱼群体遗传结构的研究,以及公鱼属所有鱼类种间关系的研究。同时,本实验得到的有效等位基因数远低于本实验室以同样方法开发微卫星序列的其他物种,由此表明,公鱼的多态性含量相对较低。


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