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卵形鲳鲹分子标记的筛选与应用

孙立元  
【摘要】:卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)具有生长速度快,食性简单,肉质鲜美,容易饲养等一系列优点,已经成为我国华南沿海地区一种重要的海水养殖品种。由于目前卵形鲳鲹未经过人工选育,在繁、育过程中随机挑取亲本可能导致近交衰退,因此急需评价卵形鲳鲹育种群体的遗传多样性水平和遗传结构,为在遗传选育中亲本选择和配对策略的制定提供参考依据。本研究采用FIASCO法构建了卵形鲳鲹微卫星(Microsatellite, SSR)富集文库,测序筛选到21个多态性微卫星位点,利用筛选的多态性微卫星位点评价了广东大亚湾和海南三亚两个育种群体遗传多样性水平和种群遗传结构,为育种群体亲本配对策略的制定提供了依据;测序获得了卵形鲳鲹线粒体基因组DNA,利用卵形鲳鲹线粒体基因组DNA序列与从GenBank数据库中下载的6种鲹科鱼类线粒体基因组DNA序列进行了系统发育关系的研究;由于从形态上很难区分卵形鲳鲹雌雄个体,给遗传育种过程中雌雄亲本的配对带来了很大的困难,为了建立雌雄个体的分子识别技术,本研究尝试利用AFLP和RAPD技术对卵形鲳鲹雌雄个体进行了全基因组扫描,以期筛选雌雄个体特异的分子标记。本研究取得的主要结果如下: (1)卵形鲳鲹微卫星标记的筛选 使用“磁珠富集法”建立了卵形鲳鲹微卫星序列富集文库,筛选文库中的阳性克隆进行测序分析,共获得了约450个菌落的微卫星富集文库,得到320个阳性克隆,测序其中的219个克隆,有150个克隆(68.5﹪)含有重复次数≧5微卫星序列;利用这些序列共设计了137对微卫星引物,其中108对引物成功扩增出预期大小的片段,利用48个卵形鲳鲹个体评价这些微卫星位点的多态性,结果表明其中21个微卫星位点具有多态性,该群体的等位基因数Na为2-10,观测杂合度HO为0.083-0.792,平均为0.585,期望杂合度He为0.081-0.886,平均为0.589,多态性信息含量PIC为0.0767-0.8623;6个位点(TO33,TO47,TO67,TO80,TO132-1,TO145)明显偏离HEW(P 0.01)。 (2)2个卵形鲳鲹育种群体遗传多样性比较分析 利用筛选的21个微卫星位点中的11个多态性微卫星位点,对海南三亚和广东大亚湾2个育种群体进行了遗传多样性比较分析,研究结果表明广东大亚湾和海南三亚2个卵形鲳鲹育种群体的平均等位基因Na分别为5.0和3.6,平均有效等位基因Ne为2.965和2.244,观测杂合度Ho分别为0.292-0.814和0.207-0.840,期望杂合度He分别为0.307-0.813和0.189-0.761,海南三亚群体中多态信息含量PIC为0.014-0.719,平均为0.509,广东大亚湾群体的PIC为0.168-0.711,平均为0.436。海南三亚群体有5个位点偏离哈迪-温伯格平衡(P0.05),广东大亚湾群体有2个位点偏离哈迪-温伯格平衡;2个群体间的遗传相似系数为0.561,遗传距离为0.578,遗传分化指数(Fst)为0.152。聚类分析和Structure软件分析显示海南三亚和广东大亚湾2个卵形鲳鲹群体各为一支,2个群体间具有较大的遗传分化,可作为2个育种群体管理,2个群体间进行杂交选育预期可获得较好的遗传进展。 (3)卵形鲳鲹性别特异性分子标记的筛选 利用AFLP和RAPD技术进行卵形鲳鲹雌雄个体的全基因组扫描,以期获得雌雄个体特异分子标记。利用64对AFLP引物组合,共扩增出2322个位点,其中18个引物组合(26.6%)产生可能与性别相关联的扩增,未筛选到雌雄个体特异的分子标记;利用238条RAPD引物筛选雌雄特异的分子标记,共有26个随机引物产生可能与性别相关联的标记,也未筛选到卵形鲳鲹雌雄个体特异性的DNA标记。 (4)卵形鲳鲹线粒体全基因组克隆及鲹科鱼类发育关系分析 根据鲹科鱼类线粒体序列同源性设计10组引物,经PCR扩增和测序分析,获得了卵形鲳鲹线粒体基因组DNA序列,线粒体基因组的大小为16564bp,其中包含13个蛋白编码基因,2个核糖体RNA基因(12SrRNA和16SrRNA),22个转运RNA基因以及一个D-loop区域,绝大部分基因为重链,只有NADH脱氢酶亚基6(ND6)和8种tRNA(Gln,Ala, Asn,Cys,Try,Glu,Pro, Ser)以轻链形式编码蛋白,与另外一个发表于NCBI的序列(KF356397)相比,两个序列的同源性为99﹪,只有在16SrRNA和Control region区域有较大的差异,分别占0.17%和1.7%,由于具有较大的序列差异,这2个基因能够为后期卵形鲳鲹种群结构的研究提供理论参考;应用邻接法,对卵形鲳鲹线粒体基因组DNA序列与6种鲹科鱼线粒体基因组DNA序列进行了系统发育关系研究,结果表明鲳鲹亚科与鰤亚科形成姐妹群,竹筴鱼属与圆鲹属形成姐妹群,两个姐妹群与若鲹属聚为一支,与副叶鲹属再聚为一支,鲹属处于鲹科类群的基部。


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