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《上海海洋大学》 2014年
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两种主要无机氮胁迫下凡纳滨对虾免疫因子变化及其对副溶血弧菌易感性的研究

葛红星  
【摘要】:氨氮和亚硝酸盐氮是对虾养殖水体中最主要的胁迫因子。水体中氨氮和亚硝酸盐氮胁迫可诱导对虾正常生理生化因子和组织结构的改变,并能改变与对虾非特异性免疫能力相关酶类活性的改变,导致对虾免疫能力下降,增加对病原体的易感性。针对2009年以来在亚洲地区爆发的凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死综合征(Acute HepatopancreasNecrosis Syndrome, AHPNS)的致病原是副溶血弧菌的报道,本文研究了不同浓度氨氮和亚硝酸盐氮胁迫下人工感染副溶血弧菌后,凡纳滨对虾相关免疫酶活性和死亡率的变化,阐明了氨氮和亚硝酸盐氮胁迫下凡纳滨对虾对副溶血弧菌易感性机理,并且探讨了生物絮团技术在室内工厂化养殖凡纳滨对虾水体中氨氮、亚硝酸盐氮清除效果和生长的影响,为研究凡纳滨对虾AHPNS爆发的环境机制提供相关资料,也为通过调控养殖环境防治该病的爆发提供理论依据。 为研究养殖水体中总氨氮胁迫对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)急性肝胰腺坏死综合征(Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome,AHPNS)发生的影响,设置了1个对照组和4个不同质量浓度氨氮实验组,即砂滤海水对照组(0.03mg·L-1)、2.5、5.0、7.5和10.0mg·L-1,胁迫20d后对虾腹肌注射副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)进行感染。凡纳滨对虾感染后6-24h,各实验组均出现死亡高峰,24h后5.0,7.5和10mg·L-1实验组对虾累积死亡率均高于2.5mg·L-1实验组,且在同一取样时间各实验组对虾累积死亡率随着氨氮浓度的升高而升高,48h后各实验组对虾不再死亡,其累计死亡率分别为0%、8%、12%、20%和36%。PO活性呈现先升高再降低的趋势,对照组、2.5和5.0mg·L-1实验组PO活性差异性不显著(P0.05),7.5和10mg·L-1实验组除12h外均显著低于对照组(P0.05)。SOD活性呈现先升高后下降的趋势,7.5和10mg·L-1实验组SOD活性在感染后除24h外均显著高于对照组(P0.05),而2.5mg·L-1实验组与对照组差异性不显著(P0.05)。对照组和2.5mg·L-1实验组对虾LSZ活性在各取样时间点差异性不显著(P0.05),7.5和10mg·L-1实验组对虾LSZ活性在3h,6h,24h,48h时间点显著低于对照组(P0.05)。感染6h后各实验组对虾肝胰腺中LvLT mRNA表达量开始上升,24h后开始下调,至72h恢复至原水平。实验结果表明,氨氮胁迫能降低凡纳滨对虾的非特异性免疫酶活性,影响对虾肝胰腺中LvLT mRNA对病原刺激的应答反应,增加对副溶血弧菌的易感性,为预防凡纳滨对虾AHPNS的爆发,养殖水体中总氨氮浓度应控制在2.5mg·L-1以下。 为研究养殖水体中亚硝酸盐氮胁迫对凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)急性肝胰腺坏死综合征(Acute Hepatopancreatic NecrosisSyndrome, AHPNS)发生的影响,设置了1个砂滤海水对照组和4个不同质量浓度亚硝酸盐氮实验组,即对照组(0.02mg·L-1)、2.0、4.0、6.0和10.0mg·L-1,胁迫20d后对虾腹肌注射副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)进行感染。凡纳滨对虾感染后9-24h,各实验组出现死亡高峰,濒死对虾表现出AHPNS相同的临床症状,48h后,各实验组对虾不再死亡,对照组和各实验组对虾累计死亡率分别为0、4%、8%、16%和24%。其中,4.0mg·L-1实验组对虾累积死亡率和2.0mg·L-1实验组差异性不显著(P0.05)但显著低于6.0和10.0mg·L-1实验组(P0.05)。感染副溶血弧菌后,对照组、2.0和4.0mg·L-1实验组凡纳滨对虾血清中ALT先上升后下降,6.0和10.0mg·L-1实验组持续上升。对照组和2.0mg·L-1实验组对虾血清AST先上升、96h后开始下降,4.0、6.0和10.0mg·L-1实验组持续升高。对照组、2.0和4.0mg·L-1实验组对虾ALP活性呈现先升高后降低的趋势,6.0和10.0mg·L-1实验组对虾ALP活性持续降低。对照组对虾LSZ活性在各取样时间点显著高于6.0和10.0mg·L-1实验组(P0.05)而与2.0和4.0mg·L-1实验组差异性不显著(P0.05)。结果表明,亚硝酸盐氮胁迫能降低凡纳滨对虾的免疫力,增加对副溶血弧菌的易感性。因此,为预防AHPNS的爆发,养殖水体中亚硝酸盐氮浓度应控制在4.0mg·L-1以下。 为研究生物絮团技术对室内工厂化养殖凡纳滨对虾水体中氨氮、亚硝酸盐氮清除效果和抗病力及生长的影响,定期向高密度(300尾·m-2、360尾·m-2和450尾·m-2)凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)工厂化养殖水体中泼洒麦麸、蔗糖和枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)发酵液,另外以300尾·m-2不添加发酵液为对照组。结果显示,各实验组水体pH值波动较小。氨氮、亚硝酸盐氮浓度缓慢上升,实验结束时,各实验组显著低于对照组(P0.01)。其中,300和360尾·m-2实验组水体中氨氮浓度始终低于2.5·m-2而对照组和450尾·m-2实验组在实验结束时氨氮浓度均高于2.5mg·L-1。养殖中后期,各实验组水体中出现较多轮虫和多种原生动物,而对照组水体中桡足类始终是优势种。各实验组对虾的血清蛋白含量均高于对照组。300尾·m-2和450尾·m-2组对虾溶菌酶活力显著高于对照组(P0.01)。各实验组对虾酚氧化酶比活力和超氧化物歧化酶比活力无显著差异(P0.05)。与对照组相比,实验组对虾的排氨率分别提高了25.8%、9.7%和19.3%。各实验组产量均高于对照组。实验结果表明,凡纳滨对虾工厂化养殖过程中,定期向养殖体中添加麦麸、蔗糖和芽孢杆菌发酵液,可以有效降低养殖水体中氨氮、亚硝酸盐氮浓度,而且有助于丰富凡纳滨对虾的饵料来源,提高对虾新陈代谢活动,提高凡纳滨对虾免疫力,增强其抗病力。但养殖密度不超过360尾·m-2为宜。
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