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《上海海洋大学》 2014年
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海水养殖源弧菌耐药性检测与整合子分析

姚小娟  
【摘要】:弧菌是一种革兰氏阴性菌,弧菌科弧菌属,弯曲成弧形,菌体短小,单端鞭毛无芽孢的短杆状细菌,分布广泛,常见于海洋环境。它是一种条件致病菌,当水质状况和宿主体质状况发生改变时,易引起大范围弧菌病的爆发。此外,副溶血弧菌、创伤弧菌和美人鱼弧菌等是人畜共患病原菌。因此,为了明确海水养殖源弧菌在不同省份和不同动物中的存在情况、结构组成,本文通过弧菌特异性培养基TCBS的筛选、生化鉴定和HSP60基因的检测,在中国江苏、浙江、福建和海南地区的发病动物和养殖池塘水最终分离得到106株弧菌,分别为:副溶血弧菌33株,哈维弧菌33株,溶藻弧菌15株,鳗弧菌9株,创伤弧菌4株,Vibriocyclitrophicus3株,霍乱弧菌3株,灿烂弧菌2株,查氏弧菌2株,拟态弧菌1株,弗尼斯弧菌1株。 检测106株海水养殖源弧菌的耐药情况,可以反映当前水产养殖中抗菌药物使用情况,并为今后的水产养殖生产用药提供一定的理论科学依据。本文首先通过纸片扩散法测量106株弧菌对八类14种常见抗菌药物的抑菌圈直径,结果显示:氨基糖苷类中的链霉素和卡那霉素是耐药最严重的药物,β-内酰胺类中的新生霉素是耐药较为严重的药物;而诺氟沙星、氟苯尼考、氯霉素和头孢曲松四种药物是敏感率较高的药物,分别为97.17%、94.34%、93.40%、92.45%;对每株弧菌的耐药谱型分析得知,对3种或3种以上抗菌药物耐药的多重耐药菌株有42株,占总数的39.62%,3耐的抗菌谱型中S/K/NV最多,占3耐总数的72.22%,12个4耐抗菌谱型比较散乱,只有两株弧菌具有相同的耐药谱型即S/NV/RD/K,占16.67%,6个5耐抗菌谱型中S/TE/SXT/RD/DO出现3次,占50%,1个7耐抗菌谱型为S/C/TE/NV/RD/DO/K,2个8耐抗菌谱型分别为E/S/C/TE/SXT/NV/RD/K和CIP/CRO/S/TE/SXT/NV/RD/FFC。其次使用肉汤微量稀释法检测106株弧菌对8种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC),结果显示:链霉素的平均MIC值最高,为80.12μg/ml,其余由大到小依次为红霉素26.47μg/ml、氯霉素8.16μg/ml、复方新诺明5.89/29.47μg/ml、头孢曲松2.73μg/ml、诺氟沙星0.94μg/ml、氟苯尼考0.92μg/ml、利福平0.48μg/ml。最后在对上述两种方法进行相关性分析,结果发现:纸片扩散法的抑菌圈直径和肉汤稀释法的MIC值呈负相关(个别药物的个别菌株除外),即两种方法的检测结果是一致的。 本文使用普通PCR技术检测106株海水养殖源弧菌的整合子-基因盒携带情况。首先,对所有分离株的5'保守端的一类、二类、三类整合酶基因和3'末端的基因进行扩增,结果显示:一类整合酶的阳性率为89.62%(95/106),二类整合酶的阳性率为0%(0/106),三类整合酶的阳性率也是0%(0/106);在对一类整合子的3'末端扩增时得知,qacEΔ1的阳性率为10.38%(11/106),Sul1基因的阳性率为11.32%(12/106)。其次,本文研究了106株弧菌分离株对三氯异氰脲酸和和苯扎溴铵两种消毒剂的最小抑菌浓度,结果显示:两种消毒剂的MIC值分别高达498.00mg/L和320mg/L,这表明弧菌分离株对消毒剂也产生一定程度的耐药性。最后,本文对一类整合子的5'保守端和3'末端都呈阳性的8株弧菌的可变区进行扩增,结果显示:其中有3株弧菌共携带两种基因盒:一株溶藻弧菌239携带arr-3-dffrA27基因盒,一株Vibrio cyclitrophicus295携带arr-3-dffrA27基因盒,一株Vibriocyclitrophicus291携带dfr16-aadA2基因盒。 综上所述,分离于四个省份的海水养殖源弧菌均对不同种类的抗菌药物和消毒剂产生了不同程度的耐药性。耐药弧菌中可移动基因原件的存在,如:整合子-基因盒系统,对耐药基因的传播产生了巨大的影响。从本文研究结果可知,在实际养殖生产中,需要定时检测弧菌的耐药性,并及时采取相应手段进行耐药性消除,使弧菌的耐药性处于安全的状态,避免由于弧菌带来的经济损失。
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S941.4

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