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《上海海洋大学》 2015年
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海水养殖源弧菌耐药性调查与致病性弧菌毒力基因检测

胡梦华  
【摘要】:由于近些年,盲目的追求高产、超高密度的养殖、技术混乱、药物滥用、病害流行、种苗质量差、环境污染等原因,对对虾的养殖带来很大的影响。为了探究弧菌在对虾养殖过程中的流行病学、耐药性以及致病性,本研究针对本实验室保存的上海、江苏、浙江、福建、海南等地海水养殖中发病对虾、鱼、蟹等的病料分理出的弧菌对这些弧菌进行耐药性的检测,利用PCR的方法检测各个菌株携带整合子的情况,对这些菌株进行耐药基因的检测,以及运用最小抑菌浓度法MIC来研究各个地区的弧菌耐药情况,针对耐药基因型和耐药表型对该菌做出正确的判断,对耐药株地区的人工养殖进行临床指导,合理利用抗生素来预防细菌性疾病,为临床指导提供了理论依据。在沿海5个省份采集到的患病动物和养殖水体等,这些样品主要采自凡纳滨对虾和青蟹的血淋巴、肝胰腺、肌肉组织等;和分离自鲈鱼、舌鳎、大菱鲆、河豚等的体表溃疡、肠道、腹水和血液样品。1、耐药性分析本文主要进行了194株弧菌对8种抗生素的MIC值和耐药基因的检测,研究了分离菌株的耐药情况,对耐药表型和耐药基因型的相关性进行了比较,简单的总结了弧菌在各地区的耐药情况。194株菌的MIC值可以看出耐药率最高的为红霉素和复方新诺明,分别为60.8%和58.2%;而对于链霉素,则处于中介范围的菌株较多,有156株;耐药率最低的药物为氟苯尼考,仅有7.7%。从不同动物分离到的弧菌对8种抗菌药物的耐药率有所不同,从鱼类分离到的弧菌耐药率相对较高,蟹类的最低且对氟苯尼考和土霉素耐药率均为0。还对194株弧菌检测了1、2、3类整合子和4类整合子所包含的整合酶基因。二类和三类整合酶均未检测到,一类整合酶检出率高达95.4%。194株菌中,其中11株菌均含有一类整合子的保守区,检出率为5.67%,但V-69、V-76、V-105这三株菌不但具有完整的整合子,而且还具有可变区基因盒。对可变区阳性PCR进行T-A克隆测序后分别得到了1308bp、1308bp和1315bp,这三株弧菌含有相同的基因盒,为利福平ADP-核糖基转移酶(Rifampin ADP-ribosylating transferase,arr-3)和二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase,dfr A27)两种耐药基因盒,分别介导利福平和甲氧苄啶耐药。2、对虾源副溶血弧菌毒力基因检测本章对试验室保存的74株对虾源副溶血弧菌进行毒力基因的检测和最近报道的副溶血弧菌pir A和pir B基因检测,和弧菌的Ⅲ型分泌系统T3SS1和T3SS2检测;并对几株副溶血弧菌进行对虾感染试验,根据24h的半致死浓度LC50,判断副溶血弧菌的致病性。检测结果tdh和trh对基因均未检测到,而tlh的检出61株,检出率为82.4%,T3SS1的检出率较高,最高的毒力基因VP1670的检出率最高为62.2%;而T3SS2的检出率较低,最低的毒力基因VPA1362检出率为0%。在副溶血弧菌中检测pir A和pir B毒力因子,检出率分别为23.0%和20.3%。3、V-76溶藻弧菌多重耐药和致病性本研究从福建省福清采集的一尾凡纳滨病虾的肠道内容物中分离得到一株溶藻弧菌,命名为:V-76。通过凡纳滨对虾回感实验和微量肉汤稀释法药敏实验来分别研究该菌株的致病性和耐药性。此外,为了探究V-76的致病性和耐药性的分子机制,本文还通过PCR方法对该菌进行了毒力基因、整合子相关基因和耐药基因的检测。凡纳滨对虾回感实验结果表明,四组分别注射了3.5×107cfu、3.5×106cfu、3.5×105cfu和3.5×104cfu V-76的对虾均发生了死亡,各组的死亡率依次为100%、100%、80%和65%。除了trh、tox R和Ure R之外,其它的毒力基因均被检出,包括tdh、tlh、tox S、Collagenase、Fla A、omp W、Asp A和fur。药敏实验结果显示,V-76对多种抗菌药物表现出耐药,如氟苯尼考(32μg.m L-1)、多西环素(32μg.m L-1)、环丙沙星(64μg.m L-1)、氯霉素(128μg.m L-1)、链霉素(512μg.m L-1)、红霉素(256μg.m L-1)、磺胺甲噁唑(2048μg.m L-1)、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑(128/2432μg.m L-1)和利福平(64μg.m L-1)。值得注意的是,V-76对后七种药物呈现出较高的耐药水平,而且其新霉素的MIC值也到达3232μg.m L-1以上。经PCR检测发现,此菌株携带有1类整合子与4类超级整合子SXT,且该1类整合子包含耐药基因盒arr2-dfr A27。此外,在菌株V-76中还检测到1型插入序列共同区ISCR1,其下游含有一个氯霉素乙酰转移酶基因cat2。另外,该菌还携带有其它耐药基因,如str A、str B、flo R和qnr VC。DNA旋转酶Gyr A和拓扑异构酶par C中的位点突变常可造成氟喹诺酮类药物耐药,但在上述两种酶中未发现氨基酸位点突变。综上所述,溶藻弧菌V-76能够导致凡纳滨对虾的发病死亡,对多种抗菌药物耐药,且携带多种独立基因和耐药基因。以上结果表明养殖源弧菌的耐药性已非常严重,提示我们应在水产养殖中规范抗菌药物的使用,以达到控制耐药菌的出现和扩散的目的。
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S941.4

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