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《上海海洋大学》 2016年
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青鳉性腺及脑miRNA鉴定

朱叶飞  
【摘要】:青鳉是进行脊椎动物发育生物学、干细胞和生殖细胞等方面研究的模式动物。它个体小、繁殖快、近交品系多、突变体多,有完整的基因组序列和数目众多的EST表达文库。与大多数鱼类不同,青鳉具有二倍体染色体结构,更有趣的是,位于青鳉雄性Y染色体上的Dmy基因决定了个体的性别以及以后的分化方向。一系列青鳉的细胞系,包括二倍体胚胎干细胞系、单倍体干细胞系、成体生殖干细胞系和从眼中分离的神经干细胞系等已成功建立。这些细胞系为研究基因功能所需的细胞生物学研究提供了良好的平台。青鳉的生殖细胞可以通过生殖细胞特异基因的启动子驱动的GFP基因进行标记,或者注射生殖细胞特异的3’UTR和GFP的融合RNA进行标记。Morpholino(MO)介导的基因敲降技术已在青鳉中广泛应用。近来,基因编辑技术的兴起,包括ZFN和TALENs,尤其时CRISP Cas9技术成为基因敲除、基因功能和机理研究的有效手段。这三种技术在青鳉中均已成功应用。越来越多的国内学者以青鳉为模式物种进行生殖细胞发育等功能研究。MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于真核生物中,长约19-24个核苷酸(nt)的内源性小分子单链非编码RNA(non-coding RNAs)。miRNA具有高度的种间保守性,通过与靶基因编码或非编码序列结合,抑制转录后翻译(植物中miRNA能靶向结合导致靶基因降解)对基因表达进行调控,广泛参与配子合成,生殖细胞增殖,个体发育等生理生化过程。性腺发育和生殖细胞发生生理过程是由系列基因参与的,并时序性,空间性表达调控的繁复过程,作为生物体内重要的调控因子,miRNA在其中发挥不可或缺的作用。从原始生殖细胞至分化为两性原代细胞,乃至到配子形成和胚胎发育等过程中都有大量miRNA在其中动态表达。通过敲除miRNA合成通路关键基因,Dicer、Drosha及DGCR8,导致性腺功能缺陷,生殖干细胞分化受阻,配子形成障碍,最终造成不育表型。证明miRNA在生物体性腺中的重要调控作用。本研究采用高通量测序技术对青鳉性腺组织小RNA深度测序,随后通过生物信息学分析,揭示青鳉性腺中miRNA表达模式,并利用Targetscan和miRanda对性别差异表达miRNA进行靶基因预测,GO功能注释和KEEG信号通路分析,随后利用实时定量PCR验证测序数据准确性及组织特异性miRNA,筛选性腺特异miRNA。荧光定量PCR验证结果与测序结果趋势一致,表明此次测序结果的可靠性。统计学分析结果显示青鳉精巢、卵巢、雄性鱼脑和雌性鱼脑中分别获得Raw reads 22,764,505、20,469,266、14,691,690和10,305,258条,精巢及卵巢中获得序列数量基本相近,约是脑组织的两倍。而筛选后可进行microRNA鉴定的Clean reads为精巢13,481,015条、卵巢11,234,426条、雄性鱼脑13,092,735条和雌性鱼脑9,802,297条,分别占原始数据的59.22%、54.88%、89.12%和95.12%。精巢、卵巢和雄性鱼脑Clean reads数目基本相近,雌性鱼脑相对较少,两性鱼脑在原始数据中占比约为性腺的两倍。通过序列比对,本研究共鉴定出118种已知miRNAs对应77种pre-miRNAs,其中107条为miRBase中已收录的青鳉miRNA序列,11条序列则为新发现的miRNA*序列。并预测了696种潜在miRNA。青鳉精巢和卵巢间显著差异表达的miRNA29个:精巢中上调miRNA16个,下调mi RNA13个。对显著差异miRNAs进行保守性分析发现,青鳉miRNAs与大马哈鱼间高度保守性,其次是人、小鼠,而与斑马鱼相比表现出较大变异。本次研究最终聚焦于青鳉mir-202-5p基因,相比于其他组织,mir-202-5p在性腺中特异表达,并具有性别二态性。双色原位杂交结果显示mir-202-5p在生殖细胞中特异表达,体内抑制青鳉mir-202-5p导致生殖细胞数量减少,迁移异常,并使得雌雄比例失调。揭示了mir-202-5p在青鳉性别分化,生殖细胞发育,尤时精巢发育等过程中具有重要作用。本研究揭示了青鳉miRNA在物种间具有较高保守性,并发现11条新miRNA,预测了大量miRNA,丰富了青鳉miRNA数据库,为后续对青鳉特定miRNA功能研究提供了基础。同时青鳉雌雄性腺间有多个miRNA差异表达,其中mir-202-5p更被发现参与性别分化及生殖细胞发育调控,拓展了对脊椎动物性别分化的认识。
【关键词】:miRNA mir-202-5p 高通量测序 青鳉 性腺
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q953
【目录】:
  • 摘要3-5
  • ABSTRACT5-10
  • 第一章 引言10-20
  • 1. miRNA的发现10
  • 2. miRNA的形成机制10-11
  • 3. miRNA的功能11-15
  • 3.1 miRNA调控多种生理过程12-14
  • 3.2 miRNA调控多种病理过程14-15
  • 4. miRNA的研究方法15-16
  • 4.1 miRNA的鉴定方法15-16
  • 4.2 miRNA的表达检测方法16
  • 5. miRNA在性腺中的作用16-19
  • 5.1 miRNA在精巢中的研究现状16-17
  • 5.2 miRNA在卵巢中的作用17-19
  • 6.青鳉性腺研究19
  • 7.本研究的目的和意义19-20
  • 第二章 日本青鳉性腺与脑小RNA文库构建和测序20-26
  • 1 材料与方法20-23
  • 1.1 仪器与试剂20
  • 1.2 Small RNA提取20-21
  • 1.3 Solexa测序21-22
  • 1.4 小RNA测序分析22-23
  • 2 结果与讨论23-26
  • 2.1 测序数据统计分析23-24
  • 2.2 序列长度分布24
  • 2.3 已知miRNA和miRNA*的鉴定24-25
  • 2.4 已知mi RNA的系统保守性比较25-26
  • 第三章 miRNA差异表达谱分析及qPCR验证26-35
  • 1 材料与方法26-30
  • 1.1 实验动物及RNA提取26
  • 1.2 定量数据分析26
  • 1.3 miRNAs差异表达分析26-27
  • 1.4 qPCR验证27-29
  • 1.5 差异miRNA靶基因预测29
  • 1.6 靶基因的功能注释29-30
  • 2 结果与讨论30-35
  • 2.1 性腺差异表达miRNA30-31
  • 2.2 差异mi RNA的靶基因预测及功能注释31-32
  • 2.3 样本miRNA表达qPCR验证32-33
  • 2.4 潜在miRNA的克隆与鉴定33-35
  • 第四章 miR2025p在青鳉性腺中的表达及功能研究35-45
  • 1. 材料与方法35-42
  • 1.1 青鳉鱼及胚胎35-36
  • 1.2 PCR产物切胶回收36-37
  • 1.3 TA克隆37
  • 1.4 转化37-38
  • 1.5 重组子筛选及测序38
  • 1.6 质粒中量制备38-39
  • 1.7 体外转录合成RNA探针39-40
  • 1.8 miR2025p反义探针40
  • 1.9 RNA双色荧光原位杂交40-42
  • 1.10 AntagomiR合成与注射42
  • 1.11 显微镜观察42
  • 2. 结果与讨论42-45
  • 2.1 miR2025p在青鳉性腺中的表达42-43
  • 2.2 miR2025p抑制对青鳉生殖细胞的影响43-45
  • 结论45-46
  • 参考文献46-55
  • 附录55-65
  • 硕士期间发表的文章65-66
  • 致谢66

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