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《上海海洋大学》 2016年
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鸡传染性支气管炎病毒H120型M、N基因的免疫原性研究

孙晓云  
【摘要】:鸡传染性支气管炎(Avian infectious bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)引起的一种鸡的急性传染性疾病,通过接触相互传染,各年龄的鸡都可发病,该病在世界范围流行十分广泛,是侵害养鸡业的最严重的传染病之一,被世界动物卫生组织(OIE)列为禽病B类传染病。由于鸡传染性支气管炎病毒(IBV)极易发生变异,经常出现新的血清型,并且不同血清型之间交叉感染现象严重,不同毒株之间基本没有交叉保护力,所以该病的免疫非常困难,鸡群内呈爆发式发生,给养禽业带来巨大的经济损失。本研究对IBV H120株基因序列进行分析,将H120株M基因和N基因构建到真核表达载体中,并对重组质粒的免疫原性进行了研究,为研制IB的DNA疫苗提供依据。1.从GenBank上下载登录号为FJ888351.1的IBV H120型的基因序列,并对其基因序列进行分析,IBV基因组编码的结构蛋白主要有3种,其中N蛋白最为保守,与病毒RNA的合成有关,并且N蛋白上有重要的抗原决定簇;而M蛋白的保守性仅次于N蛋白,可能与核衣壳蛋白结合,决定了病毒的出芽位置,在病毒复制过程中起一定作用,部分抗原决定簇也在M基因上存在。利用PrimerPremier5.0针对IBV-M和IBV-N基因分别设计一对引物,采用RT-PCR试验扩增出具有免疫保护作用的抗原基因M和N基因,通过对这两个基因的测序进行分析发现,IBV-M基因序列含有大约678个碱基,编码225个氨基酸;IBV-N基因序列含有大约1230个碱基,编码410个氨基酸。将其与GenBank上登录的其他毒株进行比较,发现其变异性小,同源率很高,其中IBV-M基因与其他毒株核苷酸序列同源性为84.7%~100%之间,相对应的氨基酸同源性为86%~100%;IBV-N基因与其他毒株核苷酸序列同源性为90.2%~100%之间,相对应的氨基酸同源性为91%~100%之间。2.将扩增出的IBV-M基因和IBV-N基因用EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切,亚克隆到pEGFP-C1-SCP-SEC载体上,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,经菌落筛选和测序,鉴定出正确的阳性克隆,完成真核表达载体的构建。将重组质粒转染到Vero细胞中,进行免疫荧光试验,可以检测到IBV-M基因和IBV-N基因在细胞内表达,并具有一定的免疫原性。这为进一步研究IBV的DNA疫苗提供了理论数据。3.将构建的真核表达载体用脂质体PEI25000按照N/P=8进行包裹,制成核酸疫苗,通过腿部肌肉多点注射进行动物免疫试验,10日龄首免,21日龄加强免疫一次,二免后用IBV H120型毒株进行攻击,连续观察15天后全部扑杀,取肾脏组织进行病毒的检测,其中H120弱毒疫苗组病毒检出率为33.3%,M质粒组病毒检出率为50%,N质粒组病毒检出率为40%,单基因的病毒检出率略高于弱毒苗组,而M+N混合质粒组病毒检出率仅为20%。明显低于弱毒苗组和单基因组。本研究制备的用PEI25000包裹的DNA疫苗,对IB的防控有重要的意义。
【关键词】:鸡传染性支气管炎病毒 M基因 N基因 核酸疫苗 动物保护实验
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S852.65
【目录】:
  • 摘要5-7
  • ABSTRACT7-9
  • 文献综述9-19
  • 第一节 鸡传染性支气管炎病的研究概况9
  • 第二节 鸡传染性支气管炎的流行病学9-10
  • 第三节 鸡传染性支气管炎病毒的分子生物学研究10-15
  • 1. IBV基因组10-11
  • 2. IBV的主要结构蛋白11-15
  • 第四节 鸡传染性支气管炎疫苗研究进展15-17
  • 1. IB弱毒疫苗15
  • 2. IB灭活疫苗15-16
  • 3. IB基因工程疫苗16-17
  • 第五节 DNA疫苗的免疫优势17-19
  • 第一章 鸡传染性支气管炎病毒H120型M,N基因的克隆及序列分析19-34
  • 1. 实验材料19-22
  • 1.1 毒株19
  • 1.2 质粒和宿主菌19
  • 1.3 鸡胚19-20
  • 1.4 数据库、生物信息学软件20
  • 1.5 主要实验仪器以及实验耗材20
  • 1.6 工具酶及实验试剂20-21
  • 1.7 常用溶液配方21-22
  • 2. 实验方法22-29
  • 2.1 鸡传染性支气管炎病毒的增殖22-23
  • 2.2 引物的设计与合成23
  • 2.3 IBV尿囊液总RNA的提取23-24
  • 2.4 反转录体系与RT-PCR反应24-25
  • 2.5 PCR产物的清洁回收25-26
  • 2.6 目的片段与克隆载体pMD18-T的连接与转化26-27
  • 2.7 阳性转化子的筛选27-28
  • 2.8 阳性转化子的双酶切鉴定28-29
  • 3. 实验结果29-32
  • 3.1 PCR扩增结果29-30
  • 3.2 阳性转化子的筛选结果30-31
  • 3.3 pMD18-IBV-M和pMD18-IBV-N的质粒双酶切鉴定31-32
  • 4. 讨论32-34
  • 第二章 鸡传染性支气管炎病毒M基因和N基因真核载体的构建和免疫原性分析34-47
  • 1. 实验材料34-35
  • 1.1 质粒和宿主菌34
  • 1.2 细胞株34-35
  • 1.3 常用分子生物学软件35
  • 1.4 主要实验仪器及耗材35
  • 1.5 工具酶及主要实验试剂35
  • 1.6 常用溶液配方35
  • 2. 实验方法35-42
  • 2.1 真核表达载体pEGFP-C1-SCP-SEC质粒的转化35-36
  • 2.2 pEGFP-C1-SCP-SEC质粒的小量抽提36
  • 2.3 pEGFP-C1-SCP-SEC质粒和pMD18-IBV-M、pMD18-IBV-N的双酶切36-37
  • 2.4 酶切产物的目的片段胶回收37-38
  • 2.5 pEGFP-C1质粒与回收产物的连接38
  • 2.6 连接产物的转化38
  • 2.7 连接产物阳性转化子的筛选(菌落PCR)38-40
  • 2.8 重组质粒的双酶切鉴定40
  • 2.9 C1-IBV-M和C1-IBV-N重组质粒的间接免疫荧光实验40-42
  • 3. 实验结果42-45
  • 3.1 菌落PCR筛选42-43
  • 3.2 C1-IBV-M和C1-IBV-N重组质粒的双酶切鉴定43-44
  • 3.3 重组质粒的间接免疫荧光实验44-45
  • 4. 讨论45-47
  • 4.1 表达载体的选择45
  • 4.2 质粒的转染及间接免疫荧光试验45-47
  • 第三章 鸡传染性支气管炎病毒M基因和N基因DNA疫苗的制备和免疫原性研究47-53
  • 1. 实验材料47-48
  • 1.1 毒株47
  • 1.2 质粒和宿主菌47
  • 1.3 实验动物47-48
  • 1.4 主要实验仪器及耗材48
  • 1.5 实验试剂48
  • 1.6 常用溶液配方48
  • 2. 试验方法48-51
  • 2.1 C1-IBV-M和C1-IBV-N质粒的大量抽提48-49
  • 2.2 质粒的纯化49-50
  • 2.3 质粒浓度和纯度的测定50
  • 2.4 脂质体的配置:50
  • 2.5 核酸疫苗的配置50
  • 2.6 DNA疫苗的免疫原性分析50-51
  • 3. 实验结果51-52
  • 4. 讨论52-53
  • 结论53-54
  • 参考文献54-70
  • 附录70-71
  • 致谢71-72
  • 硕士期间发表论文情况72

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