收藏本站
《上海海洋大学》 2016年
加入收藏

大鲵TLR7和MyD88基因结构、表达特征和功能的初步研究

黄莉莉  
【摘要】:TLR家族作为先天性免疫的重要成员之一,是机体抵御病原微生物的第一道防线,TLR识别病原相关分子模式后,通过MyD88依赖途径或TRIF信号传导途径,激活转录因子NF-κB和干扰素调节因子,从而诱导炎症因子的产生。目前在人、鼠、非洲爪蟾、斑马鱼均已发现TLR家族成员。中国大鲵(Chinese giant salamander,Andrias davidianus)俗称娃娃鱼,是我国特有的珍稀两栖类,也是世界上体形最大的两栖动物。大鲵作为原始物种,具有水生向陆生过渡的进化特征和生理学特点,因此在研究物种起源、进化和免疫系统分子生物学等方面具有重要的研究价值。然而,近年来大鲵人工养殖的快速发展,养殖病害问题日渐突出,大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovius,GSIV)感染大鲵引起重大的经济损失。因此,开展大鲵病原生物感染与宿主防御机制研究,不仅具有重要的科学意义,也具有较为广泛的应用前景。与其他水生生物相比,目前对大鲵的免疫系统以及分子免疫学研究很少。本文运用RACE-PCR技术克隆了大鲵TLR7(CgsTLR7)和MyD88(CgsMyD88)基因的cDNA全长,分析其分子结构特征与功能,利用荧光定量PCR的方法检测CgsTLR7和CgsMyD88基因在健康大鲵组织中的表达模式,以及GSIV感染后免疫基因的应答规律。并对CgsMyD88蛋白在大鲵肌肉细胞(GS-M)中的定位及其过表达对NF-κB的诱导作了初步的研究,旨在为系统研究大鲵免疫系统进化、结构功能以及抗感染分子免疫机制等奠定基础。主要结果如下:1.以大鲵肾脏组织的总RNA为模板,采用RACE PCR扩增技术,克隆得到CgsTLR7和CgsMyD88 cDNA序列全长。分别为3747bp和1423bp,预测其开放阅读框分别为3150bp和879bp,分别编码1049和292个氨基酸;其中5'UTR分别为144bp和387bp,3'UTR分别为453bp和157bp。应用SMART软件预测其功能结构域,结果显示,CgsTLR7蛋白有一个胞外信号肽、19个亮氨酸重复区域以及一个胞内TIR结构域;CgsMyD88蛋白N端存在典型死亡结构域和C端TIR结构域。并且CgsTLR7和CgsMyD88的TIR都含三个保守的Box区域,用于信号的转导。序列比对分析结果显示CgsTLR7与巴西锦龟、非洲爪蟾和鸡的同源性分别为71%、64%和65%。CgsMyD88非洲爪蟾和巴西锦龟同源性最高,均为73%,与鸡的同源性为69%。分别将CgsTLR7和CgsMyD88推定的氨基酸序列与其它脊椎动物的构建系统发育树,二者结果相似,所构建的进化树均分为两支,一枝是鱼类,另一枝是哺乳动物、禽类、爬行类和两栖类。与非洲爪蟾聚为一枝,与巴西锦龟相距也较近。2.实时荧光定量PCR分析结果显示:CgsTLR7和CgsMyD88的mRNA在所检测的组织中均有表达。其中CgsTLR7 mRNA在肝脏组织中表达水平最高,肠表达量最低;CgsMyD88 mRNA在大鲵肾脏组织中表达水平最高,肌肉和肝脏组织中表达量最低。注射大鲵GSIV后,肾、脾的CgsTLR7的表达均出现明显上调,分别在12h、48h达到峰值。大鲵感染GSIV 6h后,脾脏中MyD88的表达量出现明显的上调,24h有所降低,48h表达量达到峰值,72h后表达量降低,但仍比对照组高;在肾脏组织中,感染GSIV 6h后,MyD88表达量有所降低,48h表达量最高。以上结果表明,CgsTLR7和CgsMyD88在大鲵天然免疫中可能起着重要作用。3.构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-MyD88转染大鲵肌肉细胞(GS-M),利用间接荧光免疫化学染色技术,以抗His抗体作为一抗染色,结果显示:CgsMyD88蛋白在细胞质中有大量表达,少部分分布在细胞核中。为了验证CgsMyD88是否能够激活转录因子NF-κB,将pcDNA3.1(+)-MyD88质粒、pNF-κB-Luc质粒和pRL-TK质粒共同转染于GS-M细胞,用双荧光素酶报告基因系统检测,结果表明,转染CgsMyD88报告基因活性是对组照组的1.88倍说明CgsMyD88能够激活下游的转录因子NF-κB活性。
【关键词】:中国大鲵 TLR7 MyD88 基因克隆 结构 表达特征 NF-κB
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S917.4;Q78
【目录】:
  • 摘要5-7
  • ABSTRACT7-13
  • 第一章 文献综述13-25
  • 1 两栖类免疫系统研究和Toll样受体家族基因13-16
  • 1.1 两栖类免疫系统研究13-14
  • 1.2 Toll样受体家族基因14-16
  • 1.2.1 Toll样受体的发现14
  • 1.2.2 Toll样受体的分类与配体14-15
  • 1.2.3 Toll样受体介导的信号传导通路15-16
  • 2 TLR7基因的研究进展16-20
  • 2.1 TLR7的发现与分布16-17
  • 2.2 TLR7与配体及信号转导途径17-18
  • 2.2.1 TLR7配体17
  • 2.2.2 TLR7信号转导途径17-18
  • 2.3 TLR7的生物学功能18-20
  • 2.3.1 TLR7介导抗病毒效应18-19
  • 2.3.2 TLR7与自身免疫疾病19
  • 2.3.3 TLR7在抗肿瘤研究中的作用19-20
  • 2.3.4 TLR7可以介导凋亡20
  • 3 髓样分化因子88基因(MyD88)及其研究进展20-23
  • 3.1 MyD88基因的发现和分布20-21
  • 3.1.1 MyD88基因的发现20-21
  • 3.1.2 分布21
  • 3.2 MyD88介导的信号传导21-22
  • 3.2.1 IL-1Rs受体家族的信号传导21-22
  • 3.2.2 Toll/TLR家族的信号转导22
  • 3.2.3 IFN-γ-R信号传导途径22
  • 3.3 MyD88的生物学功能22-23
  • 3.3.1 信号通路的转接蛋白22
  • 3.3.2 MyD88参与多种疾病的发生22-23
  • 4 中国大鲵及其病害23-24
  • 5 研究的目的与意义24-25
  • 第二章 大鲵TLR7和MyD88基因的克隆与生物学信息分析25-44
  • 1 材料与方法26-34
  • 1.1 材料26-28
  • 1.1.1 实验动物、菌种和质粒26
  • 1.1.2 主要试剂和耗材26-27
  • 1.1.3 主要实验仪器27-28
  • 1.2 实验方法28-34
  • 1.2.1 大鲵肾脏组织总RNA的提取28
  • 1.2.2 5'-RACE和3'-RACE末端cDNA合成28-29
  • 1.2.3 设计简并引物扩增MyD88中间序列序列29-30
  • 1.2.4 扩增中间序列30
  • 1.2.5 RACE法扩增大鲵TLR7和MyD88基因cDNA全长30-31
  • 1.2.6 目的片段回收31-32
  • 1.2.7 连接与转化32
  • 1.2.8 阳性克隆的筛选与鉴定32-33
  • 1.2.9 生物信息学分析33-34
  • 2 实验结果34-42
  • 2.1 大鲵TLR7(CgsTLR7)和MyD88(CgsMyD88)的核苷酸序列和氨基酸序列分析34-37
  • 2.2 CgsTLR7和CgsMyD88氨基酸多序列比对分析37-41
  • 2.3 CgsTLR7和CgsMyD88氨基酸进化树分析41-42
  • 2.3.1 CgsTLR7进化树分析41
  • 2.3.2 CgsMyD88氨基酸进化树分析41-42
  • 3 讨论42-44
  • 第三章 大鲵TLR7和MyD88基因的组织表达和诱导表达分布44-54
  • 1 材料和方法44-48
  • 1.1 材料44-46
  • 1.1.1 实验材料、细胞和病毒44-45
  • 1.1.2 实验试剂和耗材45
  • 1.1.3 主要实验仪器45-46
  • 1.2 实验方法46-48
  • 1.2.1 病毒培养与滴度测定46
  • 1.2.2 病毒滴度测定46-47
  • 1.2.3 各组织RNA的提取和cDNA合成47
  • 1.2.4 荧光定量PCR检测CgsTLR7和CgsMyD88在各组织中的分布47-48
  • 1.2.5 GSIV感染后CgsTLR7和CgsMyD88基因表达特征48
  • 1.2.6 数据分析48
  • 2 实验结果48-52
  • 2.1 荧光定量检测CgsTLR7和CgsMyD88在大鲵各组织表达分布48-50
  • 2.2 GSIV感染后大鲵CgsTLR7和CgsMyD88在大鲵脾、肾组织的表达特征50-52
  • 3 讨论52-54
  • 第四章 大鲵MyD88基因真核表达载体的构建及功能研究54-68
  • 1 材料与方法54-62
  • 1.1 材料54-56
  • 1.1.1 细胞和病毒54
  • 1.1.2 实验试剂和耗材54-55
  • 1.1.3 实验仪器和设备55-56
  • 1.2 实验方法56-62
  • 1.2.1 真核表达质粒pCDNA3.1(+)-MyD88载体的构建56-60
  • 1.2.1.1 CgsMyD88ORF片段扩增56-57
  • 1.2.1.2 pMD19-T-MyD88质粒的提取57-58
  • 1.2.1.3 目的基因MyD88、pcDNA3.1(+)的双酶切58
  • 1.2.1.4 转染用pcDNA3.1(+)-MyD88质粒的制备58-60
  • 1.2.2 CgsMyD88蛋白在GS-M细胞中的定位60-61
  • 1.2.2.1 pcDNA3.1(+)-MyD88转染GS-M细胞60
  • 1.2.2.2 间接荧光免疫检测GS-M细胞中MyD88蛋白的表达60-61
  • 1.2.3 NF-κB荧光素酶报告基因分析61-62
  • 1.2.3.1 质粒转染GS-M细胞61
  • 1.2.3.2 荧光素酶活性的测定61-62
  • 2 实验结果62-66
  • 2.1 pcDNA3.1(+)-MyD88表达质粒的构建62-65
  • 2.1.1 CgsMyD88基因ORF的扩增62-63
  • 2.1.2 阳性克隆的筛选63-64
  • 2.1.3 pcDNA3.1(+)-MyD88的酶切与鉴定64-65
  • 2.2 CgsMyD88蛋白在GS-M细胞中的定位65-66
  • 2.3 CgsMyD88激活转录因子NF-κB66
  • 3 讨论66-68
  • 结论68-69
  • 参考文献69-78
  • 附录一78-80
  • 附录二80-81
  • 致谢81

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 陈锦荣;基因克隆[J];微生物学免疫学译刊;1985年02期
2 陈启军,李德昌;基因克隆的几种常用方法[J];中国兽医学报;1999年01期
3 涂友斌,王纪;图位基因克隆[J];生物学杂志;1999年03期
4 ;中国克隆出解毒酶基因[J];世界热带农业信息;2000年03期
5 ;“九五”期间我国人类遗传性疾病基因克隆研究取得重大进展[J];中国科技奖励;2001年04期
6 周莎莎;;基因克隆与表达研究进展[J];现代农业科技;2008年22期
7 王桂花;孙霞;王致远;赵德明;;小鼠脑14-3-3ζ蛋白的基因克隆及鉴定[J];中国畜牧兽医;2009年04期
8 戴顺志;;1983年基因工程回顾[J];国外医学(免疫学分册);1984年06期
9 董龙英;凌俊;;高等植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因结构及其基因表达的调节[J];植物生理学通讯;1991年06期
10 颜真,韩苇,李芳梅,赵宁,张英起;重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因的克隆与表达[J];第四军医大学学报;1994年05期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张春美;;论基因伦理的存在之基[A];生命、知识与文明:上海市社会科学界第七届学术年会文集(2009年度)哲学·历史·文学学科卷[C];2009年
2 张宪省;宿红艳;李全梓;李兴国;白书农;陆文梁;;风信子(Hyacinthus orientalis)HOM1基因的克隆与表达分析[A];西部大开发 科教先行与可持续发展——中国科协2000年学术年会文集[C];2000年
3 宿红艳;李全梓;李兴国;白书农;陆文樑;张宪省;;风信子(Hyacinthus orientalis)HOM1基因的克隆与表达分析[A];全国植物分子生物学与生物技术学术研讨会论文集[C];2000年
4 魏力;方加玮;周俊初;李友国;;一株海洋单胞菌的分离、鉴定和相关功能基因克隆[A];2006中国微生物学会第九次全国会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2006年
5 王怡;印莉萍;;OsArhI基因的克隆及功能分析[A];中国植物生理学会第十次会员代表大会暨全国学术年会论文摘要汇编[C];2009年
6 王盛;钟伏弟;张永江;吴祖建;林奇英;谢联辉;;海藻孔石莼中一种抗病毒蛋白的分离纯化和基因克隆[A];第三次全国植物病毒和病毒防治学术研讨会论文集[C];2003年
7 张上隆;;类胡萝卜素合成的相关基因及其基因工程[A];张上隆果树学文选[C];2006年
8 毕延震;郑新民;乔宪凤;刘西梅;周荆荣;华文君;李莉;肖红卫;张立苹;华再东;魏庆信;;一种无缝基因克隆方法[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十六届学术研讨会论文集[C];2012年
9 李安娜;徐荣艳;申晨;郭晓红;李多川;;嗜热毛壳菌热稳定酶的基因克隆、表达及分子改造[A];2010年中国菌物学会学术年会论文摘要集[C];2010年
10 岳文;王冬梅;袁红丰;裴雪涛;;干细胞分化调控新基因的筛选及其功能研究[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 汪敏华;成功克隆2.1万个功能基因[N];解放日报;2004年
2 张学全;克隆人类全长功能基因获突破[N];中国高新技术产业导报;2004年
3 本报实习记者 王新佳;基因:改变人类命运的新技术[N];中国高新技术产业导报;2001年
4 张汝金;发现37条人类新基因[N];解放军报;2003年
5 记者 谢军;SARS病毒基因克隆、蛋白质表达等取得最新进展[N];光明日报;2003年
6 本报实习记者 申音 记者 王旗;基因不是.com[N];中国经营报;2000年
7 本报记者 周立文 本报通讯员 丁学国;中国基因三个人物与一个事业[N];光明日报;2000年
8 记者 张学全;克隆人类全长功能基因获得重大进展[N];新华每日电讯;2004年
9 张武 本报记者 徐兰山;打造基因“王国”[N];科技日报;2003年
10 本报记者 吕媛;基因控制家蚕生男不生女[N];北京科技报;2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 蒋桂雄;油桐种子转录组解析及油脂合成重要基因克隆[D];中南林业科技大学;2015年
2 熊华淇;常染色体隐性遗传性多囊肾相关新基因的克隆及其特征[D];汕头大学;2002年
3 张高华;獐茅离子转运蛋白基因AlNHX1与AlHAK1的克隆与表达研究[D];大连理工大学;2008年
4 王学仁;担子菌毛头鬼伞的TMV抗性蛋白y3基因的分离、鉴定和表达[D];西北大学;2010年
5 吕鸿雁;枯草芽孢杆菌中甲硫氨酸氨基肽酶基因的克隆与功能研究[D];中国协和医科大学;2002年
6 苏伟;水稻程序性细胞死亡相关基因的克隆和功能分析[D];复旦大学;2006年
7 温建国;灰飞虱免疫相关基因及微管蛋白基因的克隆和分子鉴定[D];复旦大学;2004年
8 李梅章;人类新基因的分离和鉴定研究[D];中国协和医科大学;2000年
9 生书晶;何首乌芪合酶基因(FmSTS)的克隆、鉴定及转化拟南芥研究[D];华南理工大学;2010年
10 陈文;人成骨蛋白-1成熟肽基因的克隆和序列分析、5’端修饰及其在大肠杆菌中的表达[D];第四军医大学;1997年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈峰;拟南芥SDL基因的分离与功能互补验证[D];湖南农业大学;2010年
2 陈晓兵;白芥CBL基因克隆及其在干旱胁迫下的表达分析[D];郑州大学;2015年
3 姜文静;刚地弓形虫RH株ROP10基因真核表达载体的构建及其免疫原性分析[D];河北医科大学;2015年
4 宋彬彬;褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis)β-actin基因克隆分析[D];中国海洋大学;2015年
5 刘晶莹;欧洲葡萄芪合酶基因的克隆、表达及其进化分析[D];辽宁师范大学;2015年
6 席海秀;小麦TaNCED3基因克隆及功能分析[D];辽宁师范大学;2015年
7 张蕊;刺参半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆、原核表达及其在自溶中的变化规律研究[D];大连工业大学;2014年
8 钱小莉;Bt肠毒素基因的序列分析及安全性研究[D];福建农林大学;2015年
9 林志聪;花生维生素E合成相关基因的克隆与鉴定[D];福建农林大学;2013年
10 王琳琳;盐胁迫下甜菜M14品系差异表达基因的研究[D];黑龙江大学;2013年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026