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《上海海洋大学》 2016年
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大鲵TLR7和MyD88基因结构、表达特征和功能的初步研究

黄莉莉  
【摘要】:TLR家族作为先天性免疫的重要成员之一,是机体抵御病原微生物的第一道防线,TLR识别病原相关分子模式后,通过MyD88依赖途径或TRIF信号传导途径,激活转录因子NF-κB和干扰素调节因子,从而诱导炎症因子的产生。目前在人、鼠、非洲爪蟾、斑马鱼均已发现TLR家族成员。中国大鲵(Chinese giant salamander,Andrias davidianus)俗称娃娃鱼,是我国特有的珍稀两栖类,也是世界上体形最大的两栖动物。大鲵作为原始物种,具有水生向陆生过渡的进化特征和生理学特点,因此在研究物种起源、进化和免疫系统分子生物学等方面具有重要的研究价值。然而,近年来大鲵人工养殖的快速发展,养殖病害问题日渐突出,大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovius,GSIV)感染大鲵引起重大的经济损失。因此,开展大鲵病原生物感染与宿主防御机制研究,不仅具有重要的科学意义,也具有较为广泛的应用前景。与其他水生生物相比,目前对大鲵的免疫系统以及分子免疫学研究很少。本文运用RACE-PCR技术克隆了大鲵TLR7(CgsTLR7)和MyD88(CgsMyD88)基因的cDNA全长,分析其分子结构特征与功能,利用荧光定量PCR的方法检测CgsTLR7和CgsMyD88基因在健康大鲵组织中的表达模式,以及GSIV感染后免疫基因的应答规律。并对CgsMyD88蛋白在大鲵肌肉细胞(GS-M)中的定位及其过表达对NF-κB的诱导作了初步的研究,旨在为系统研究大鲵免疫系统进化、结构功能以及抗感染分子免疫机制等奠定基础。主要结果如下:1.以大鲵肾脏组织的总RNA为模板,采用RACE PCR扩增技术,克隆得到CgsTLR7和CgsMyD88 cDNA序列全长。分别为3747bp和1423bp,预测其开放阅读框分别为3150bp和879bp,分别编码1049和292个氨基酸;其中5'UTR分别为144bp和387bp,3'UTR分别为453bp和157bp。应用SMART软件预测其功能结构域,结果显示,CgsTLR7蛋白有一个胞外信号肽、19个亮氨酸重复区域以及一个胞内TIR结构域;CgsMyD88蛋白N端存在典型死亡结构域和C端TIR结构域。并且CgsTLR7和CgsMyD88的TIR都含三个保守的Box区域,用于信号的转导。序列比对分析结果显示CgsTLR7与巴西锦龟、非洲爪蟾和鸡的同源性分别为71%、64%和65%。CgsMyD88非洲爪蟾和巴西锦龟同源性最高,均为73%,与鸡的同源性为69%。分别将CgsTLR7和CgsMyD88推定的氨基酸序列与其它脊椎动物的构建系统发育树,二者结果相似,所构建的进化树均分为两支,一枝是鱼类,另一枝是哺乳动物、禽类、爬行类和两栖类。与非洲爪蟾聚为一枝,与巴西锦龟相距也较近。2.实时荧光定量PCR分析结果显示:CgsTLR7和CgsMyD88的mRNA在所检测的组织中均有表达。其中CgsTLR7 mRNA在肝脏组织中表达水平最高,肠表达量最低;CgsMyD88 mRNA在大鲵肾脏组织中表达水平最高,肌肉和肝脏组织中表达量最低。注射大鲵GSIV后,肾、脾的CgsTLR7的表达均出现明显上调,分别在12h、48h达到峰值。大鲵感染GSIV 6h后,脾脏中MyD88的表达量出现明显的上调,24h有所降低,48h表达量达到峰值,72h后表达量降低,但仍比对照组高;在肾脏组织中,感染GSIV 6h后,MyD88表达量有所降低,48h表达量最高。以上结果表明,CgsTLR7和CgsMyD88在大鲵天然免疫中可能起着重要作用。3.构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-MyD88转染大鲵肌肉细胞(GS-M),利用间接荧光免疫化学染色技术,以抗His抗体作为一抗染色,结果显示:CgsMyD88蛋白在细胞质中有大量表达,少部分分布在细胞核中。为了验证CgsMyD88是否能够激活转录因子NF-κB,将pcDNA3.1(+)-MyD88质粒、pNF-κB-Luc质粒和pRL-TK质粒共同转染于GS-M细胞,用双荧光素酶报告基因系统检测,结果表明,转染CgsMyD88报告基因活性是对组照组的1.88倍说明CgsMyD88能够激活下游的转录因子NF-κB活性。
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S917.4;Q78

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