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《上海海洋大学》 2016年
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金鱼Tgf2转座酶功能性结构域的研究

沈晓丹  
【摘要】:转座子是基因组中存在的一种可从一个位点“跳跃”到另一个位点的特殊序列,在非同源基因之间也可完成“跳跃”过程的DNA片段。转座子可分为两个大种类:反转录转座子和DNA转座子。反转录转座子在自然界中广泛存在,但在高等植物中的存在更为丰富。另一类别为DNA转座子,以DNA-DNA方式存在的转座子(class II TEs),它可以通过DNA复制或者直接剪切来获得“跳跃”片段,再插入到DNA序列中。此类转座子又细分为两类,分别是自主转座子和非自主转座子。本实验中的主要实验对象Tgf2转座子,正是class II TEs转座子中的自主性DNA转座子。Tgf2转座子在金鱼中首次被发现,隶属于hAT超家族,是目前发现的第二例在脊椎动物中具有自主转座活性的DNA转座子。该转座子全长为4720bp,包含有四个开放阅读框,可转录出最长686氨基酸的转座酶蛋白。转座子发挥功能需要两个必要条件的参与,要有特异性不对称的末端重复序列,以及具有活性的转座酶。因此Tgf2转座子,作为一种具有自主活性的转座子,转座酶在其发挥功能的过程当中发挥了至关重要的作用,它是催化DNA断裂和重组的关键元件。在本文中,针对Tgf2转座酶的功能性结构展开了一系列预测与研究。(1)首先利用SWISS-MODEL蛋白分析、Phyre2蛋白分析系统,对Tgf2转座酶蛋白同源建模和折叠识别建模,进行蛋白质结构分析预测。通过对其氨基酸序列的全序列和部分序列比对,得到在Tgf2转座酶接近N端的部分具有一个锌指BED结构域(65-120aa)的结构,在与模板的比对得到C2H2关键位点,该锌指结构域与顺式调控元件的识别、结合有关;在锌指结构下游具有一个“螺旋-转角-螺旋”(HTH)结构(153-213aa),起到转座酶聚合形成二聚体的作用;而在HTH的下游发现一个较长的结构域,类RNase H催化结构域(211-683aa)。类RNase-H催化结构域中一般存在具有高度保守的活性位点,因此利用Clustal X 1.83比对了Tgf2转座酶与其他此家族的序列得到了三个保守的位点DDE(228aa、295aa、648aa)。利用cNLS mapper分析Tgf2转座酶氨基酸全序列,预测到一段长度为15aa的单分型核定位信号llfspkrarldtnnf。(2)为研究tgf2转座酶蛋白质的核定位信号情况,利用已有的tgf2转座酶cdna全长序列tgf2tp,根据核定位信号一般研究方法,得到三种缺失突变的序列,分别是删除了tgf2转座酶n端锌指bed结构域tgf2tp△120n;c端31个氨基酸tgf2tp△31c;以及保留了cnlsmapper预测的序列tgf2tp△16c,即删除预测结果下游剩余的16个氨基酸。将不同长度的dna序列构建入带有egfp绿色荧光蛋白的质粒pegfp-c1中,分别通过脂质体转染瞬时转染入293t细胞中。结果表明,完整的tgf2转座酶具有一定的核定位倾向,39.93%的比例完全进入到细胞核中,细胞质中无荧光表达;切除了n端锌指bed结构域的tgf2转座酶结果与完整tgf2转座酶相似,38.33%的蛋白完全进入到细胞核中,说明锌指bed结构中不含有影响蛋白定位的结构;当转染pegfp-c1-tgf2tp△31c,没有细胞可以单独完全的在细胞核中表达荧光,仅有67.17%细胞其荧光弥散分布在整个细胞中,说明荧光蛋白无法完全定位入细胞核中;但是转染pegfp-c1-tgf2tp△16c即保留了预测的核定位序列后,40%细胞可在细胞核中独立表达即细胞质中则无荧光表达。因此得到结论,tgf2转座酶具有进入细胞核的能力;cnlsmapper的预测的序列llfspkrarldtnnf,是可以影响tgf2转座酶蛋白定位倾向的条件。(3)为探究tgf2转座酶中类rnaseh催化结构域中的活性中心dde是否会影响转座体系的效率。在实验中,设立两个对照组,阳性对照为原始的tgf2转座酶pcs2-tgf2tp体外转录的mrna与供体质粒ptgf2-ef1α-egfp注射胚胎;阴性对照为仅注射供体质粒ptgf2-ef1α-egfp。实验组为,利用点突变方法将三个关键氨基酸突变为d228n、d295n、e648q;并得到三种辅助质粒pcs2-tgf2tpd228n、pcs2-tgf2tpd295n、pcs2-tgf2tpe648q,将其体外转录为mrna,分别同相同的供体质粒dna(ptgf2-ef1α-egfp)一同打入到1-2细胞器的斑马鱼胚胎中。分别观察12小时、24小时和出膜后平游期斑马鱼的荧光表达情况。在观察中可以发现突变后的mrna削弱了介导供体质粒在斑马鱼中表达绿色荧光的水平,出膜后其身体的荧光表达仅在其背部肌肉上少量表达,与可以通体表达的原始tgf2转座酶mrna形成明显对比,表达更接近于阴性对照组。将饲养的实验鱼提取dna,利用pcr检测egfp标记基因的阳性率,三种点突变的整合率均与阴性对照组相一致,阳性率相比原始转座酶差异明显。可以说明,点突变后的Tgf2转座酶蛋白的功能发生了变化,并造成转座效率明显下降;进一步验证类RNase-H催化结构域的活性中心DDE对转座体系的高效率转座具有重要意义。
【关键词】:转座子 Tgf2 转座酶 核定位信号 DDE
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q78
【目录】:
  • 摘要4-7
  • Abstract7-12
  • 引言12-17
  • 第一章 Tgf2转座酶结构域的预测17-24
  • 1.1 实验材料、软件17-18
  • 1.1.1 实验材料17
  • 1.1.2 实验使用软件17
  • 1.1.3 实验方法17-18
  • 1.2 实验结果18-22
  • 1.2.1 Tgf2转座酶结构域分析18-20
  • 1.2.2 Tgf2转座酶同源比对分析20-21
  • 1.2.3 Tgf2转座酶核定位信号分析21-22
  • 1.3 讨论22-24
  • 第二章 Tgf2转座酶核定位信号的鉴定24-41
  • 2.1 实验材料24-26
  • 2.1.1 实验材料24
  • 2.1.2 主要仪器24-25
  • 2.1.3 主要化学和生物试剂25-26
  • 2.2 实验方法26-32
  • 2.2.1 试剂配方26-27
  • 2.2.2 Tgf2转座酶cDNA片段的获得27-28
  • 2.2.3 构建质粒28-30
  • 2.2.4 细胞培养和传代30-32
  • 2.2.5 瞬时转染32
  • 2.2.6 细胞核染色32
  • 2.3 实验结果32-38
  • 2.3.1 质粒构建32-36
  • 2.3.2 核定位信号观察及数量统计36-38
  • 2.4 讨论38-41
  • 第三章 Tgf2转座酶DDE催化活性位点的研究41-56
  • 3.1 实验材料、方法41-42
  • 3.1.1 实验材料41
  • 3.1.2 主要仪器41-42
  • 3.2 实验方法42-49
  • 3.2.1 Tgf2转座酶点突变42-46
  • 3.2.2 转座酶mRNA制备46-48
  • 3.2.3 供体质粒提取48
  • 3.2.4 显微注射、子代培育48
  • 3.2.5 荧光观察、绿色荧光蛋白(EGFP)基因组阳性率检测48-49
  • 3.3 实验结果49-54
  • 3.3.1 点突变辅助转座酶49-50
  • 3.3.2 绿色荧光蛋白观察50-52
  • 3.3.3 基因阳性率检测52-54
  • 3.4 讨论54-56
  • 结论和展望56-58
  • 参考文献58-65
  • 附录65-66
  • 致谢66

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1 沈晓丹;金鱼Tgf2转座酶功能性结构域的研究[D];上海海洋大学;2016年
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