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《上海海洋大学》 2016年
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WSSV流行变异比较及不同毒株致病差异分析

孙新颖  
【摘要】:对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)是养殖虾主要病原之一,WSSV不同地理株的变异可能导致WSSV毒力的变化,本论文针对2013-2015年我国主要对虾养殖区WSSV变异进行分析,同时分析了不同毒力WSSV感染凡纳滨对虾mi RNA的差异表达。主要研究内容及结果如下:第一章:为了了解中国不同地区白斑综合征病毒的流行变异情况,本研究取用2013年3―12月从7个省市发病地区采集到的64份WSSV阳性样本,以特异的引物扩增目的片段,通过测序分析不同样本的缺失及变异差异。结果显示,在ORF14/15扩增中,分别有6530 bp、6533 bp和5138 bp的片段缺失,而在ORF23/24扩增中有12070 bp大片段的缺失,不同地区样本中未能成功扩增ORF75,而ORF94的重复单元数目分别为0、3、4、12不等,ORF125的重复单元数目为0、7。SNP分析表明,含有3个RUs的ORF94在48位的碱基为T、T、T,RUs为4的在48位的碱基为T、T、T、T,RUs为12的在48位的碱基分别为T及11个A。而ORF125所有RUs为7的情况在8、18、25、66、69位置的碱基均为G、G、G、G、A,在9、50、53、61位的碱基也普遍出现了变异。结果表明,WSSV在中国不同地区存在一定程度的变异,其在序列中的缺失以及重复单元数目和SNP的差异较为明显。第二章:为了了解2014年中国大部分地区WSSV ORF14/15、ORF23/24、ORF75、ORF94和ORF125的变异情况,本文选择2014年1月至8月期间采集的48份WSSV阳性样本,用特异引物扩增片段,连接于T载体转化至Top10中,筛选阳性克隆,测序分析不同样本之间的缺失差异。结果显示,在ORF14/15扩增中,共有四种缺失情况,即缺失6540 bp、6530 bp、5908 bp和5138 bp。而在ORF23/24扩增中有两种缺失情况,即缺失12070 bp和12064 bp。ORF75的总重复单元数目有4、10、11、12、13不等,ORF94的重复单元数目有4和14不等,而ORF125的重复单元数目有0、3、5、6、7不等。WSSV在中国大部分地区存在一定程度的变异,而不同毒株之间在ORF14/15可变区差异比较明显,在ORF23/24可变区差异不大,但均具有大片段缺失,且毒株间在0RF75、ORF94和ORF125中重复单元数目存在比较明显的差异。第三章:本实验针对2015年4月至10月期间在山东、江苏、天津、浙江、海南、广东五省市,采集到的57份检测WSSV显示阳性的样本,通过特异性的扩增目的片段,比较不同地区、不同分离株之间在ORF14/15、ORF23/24上的缺失变异情况,以及ORF75、ORF94和ORF125上的重复单元数目差异。结果显示,在ORF14/15扩增中,分别有6530 bp、5908 bp和5725 bp的片段缺失,而在ORF23/24扩增中均有12070 bp大片段的缺失,ORF75的45 bp的重复单元数目分别为1、2、3,102bp的重复单元数目均为1,而ORF94的重复单元数目分别为4、5、10、12不等,ORF125的重复单元数目为3、5、6。第四章:WSSV基因组之间的差异也引起了不同分离株之间毒力的差异。MiRNA在防御病毒的调节中起着重要的作用。为了探究凡纳滨对虾在经过不同毒力的WSSV感染后,mi RNA的差异表达,将高毒力和低毒WSSV感染后对虾的肝胰腺作为实验样本,通过高通量测序,建立了H文库和L文库。H文库中有29,398,623个raw reads,而在L文库中有29,398,623 raw reads。一共有37个差异表达的功能性mi RNA,相对于低毒力的表达情况,其中上调的mi RNA有16个,而下调的mi RNA有21个。Igi-mi R-1175-3p是差异最为显著的mi RNA,其次分别是bmo-mi R-1175-3p和ipu-mi R-26b。根据差异mi RNA预测的靶基因在生物过程、信号调节、细胞分化和凋亡、免疫识别和其他过程中发挥关键作用。实验结果对于针对不同毒力感染后的mi RNA差异反应的后续研究起到一定作用。
【关键词】:WSSV ORF 变异 毒力 miRNA
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S945.4
【目录】:
  • 摘要4-6
  • ABSTRACT6-11
  • 引言11-18
  • 1、WSSV宿主范围及传播途径11-12
  • 1.1 宿主范围11-12
  • 1.2 传播途径12
  • 2、WSSV形态学12-13
  • 3、WSSV基因组学13-16
  • 3.1 ORF23/2413-14
  • 3.2 ORF14/1514
  • 3.3 ORF7514-15
  • 3.4 ORF9415
  • 3.5 ORF12515
  • 3.6 致病力差异15-16
  • 4、WSSV转录组学16-18
  • 4.1 转录组学由来16
  • 4.2 转录组学技术16-17
  • 4.3 miRNA17-18
  • 第一章 2013年中国典型对虾养殖区白斑综合征病毒流行株高变异区序列的分析比较18-30
  • 1 实验材料与方法19-23
  • 1.1 实验材料19-20
  • 1.2 实验方法20-23
  • 2 结果与分析23-28
  • 2.1 套式PCR检测结果23-24
  • 2.2 扩增结果24-26
  • 2.3 序列比对26-28
  • 3 讨论28-30
  • 第二章 2014年中国典型对虾养殖区白斑综合征病毒流行株高变异区序列的分析比较30-40
  • 1 实验材料与方法30-32
  • 1.1 实验材料30-32
  • 1.2 实验方法32
  • 2 结果与分析32-38
  • 2.1 PCR检测结果32
  • 2.2 扩增结果32-36
  • 2.3 序列比对36-38
  • 3 讨论38-40
  • 第三章 2015年中国典型对虾养殖区白斑综合征病毒流行株高变异区序列的分析比较40-49
  • 1 实验材料与方法40-42
  • 1.1 实验材料40-42
  • 1.2 实验方法42
  • 2 结果与分析42-47
  • 2.1 PCR检测结果42-43
  • 2.2 扩增结果43-46
  • 2.3 序列比对46-47
  • 3 讨论47-49
  • 第四章 不同毒力WSSV感染凡纳滨对虾的microRNA表达49-59
  • 1 材料与方法49-53
  • 1.1 实验材料49-50
  • 1.2 病毒感染与样本采集50
  • 1.3 RNA的提取50
  • 1.4 cDNA文库建立和测序50-52
  • 1.5 测序数据预处理和注释分析52
  • 1.6 miRNA保守性分析52
  • 1.7 miRNA的差异表达52
  • 1.8 差异表达miRNA的靶基因预测52-53
  • 2 实验结果53-58
  • 2.1 miRNA的长度分布53
  • 2.2 miRNA的鉴别和注释分析53-54
  • 2.3 miRNA的差异表达和靶基因的预测54-58
  • 3 讨论58-59
  • 参考文献59-65
  • 致谢65

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