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《上海海洋大学》 2016年
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斑马鱼低温响应顺式调控元件的功能鉴定及ciarta基因启动子低温诱导核心区域的鉴定

张东  
【摘要】:作为变温动物的硬骨鱼类其体温会随着生活环境中水温的变化而改变,但是目前鱼类应对温度变化的调节机制和分子网络还不是很清楚。顺式调控元件(cis-element)是一段特异的具有转录调节功能的DNA序列,反式作用因子(trans-factor)能够结合到该特异序列上,两者结合共同调控下游基因的表达。之前的研究表明,顺式作用元件AGMAACCA和SAGTCAA富集于斑马鱼冷相关的基因中。本研究通过体内实验验证了这两个调控元件的低温响应功能。本实验将顺式作用元件(AGMAACCA和SAGTCAA)和突变序列克隆到基于Tol2转座子的EGFP报告系统载体上,利用显微注射技术导入到斑马鱼一细胞期受精卵的动物极中,通过荧光定量PCR技术定量判断启动子下游基因egfp的m RNA表达水平,鉴定cis-element温度诱导表达的能力。结果显示,顺式作用元件AGMAACCA在低温下能诱导下游基因egfp的表达;而顺式作用元件SAGTCAA在低温下抑制下游基因egfp的表达。把其核心的结合序列进行全部突变成若干个胸腺嘧啶之后,其调控能力显著下降。本实验鉴定出的两个全新的cis-element:一个是在低温下能显著诱导下游基因表达,一个是低温下能显著抑制下游基因表达。这两个调控元件的鉴定为阐述低温下鱼类的调控机制提供了新的思路。之前研究表明在低温胁迫下斑马鱼多个组织中,ciarta(circadian associated repressor of transcription a),也称为c1orf51,基因表达被广泛诱导。ciarta基因是与节律表达相关的抑制因子,参与了生物的生物钟。低温下,ciarta基因被显著诱导表达更多的是为了调控一些基因合成新的物质,从而帮助有机体应对外界环境中的低温胁迫。为了鉴定ciarta启动子中受低温响应的最敏调控区域,本研究克隆了5个不同长度的截短片段(-1992~+100 bp,-1354~+100 bp,-881~+100 bp,-634~+100 bp和-247~+100 bp),插入到荧光素酶报告载体p GL4.10中,转染到斑马鱼来源的ZF4细胞中,来研究这5个截短片段的低温诱导基因表达的能力。p GL4.10载体上包含了荧光素酶基因,通过荧光定量PCR技术可以定量分析低温下荧光素酶基因在m RNA水平上的表达情况,从而判断p GL4.10载体上不同长度的启动子其低温诱导活性。结果表明,低温条件下,5个截短片段都能显著诱导下游基因的表达。其中,-1992~+100bp截短片段其下游基因表达倍数为3.99±0.37倍;-1354~+100 bp为4.04±0.22倍;-881~+100 bp为5.61±0.53倍;-634~+100 bp为4.27±0.42倍;-247~+100 bp为4.22±0.05倍;p GL4.23为1.56±0.23倍。由此可以看出-881~+100 bp截短片段表现出最高的启动子活性(达5.61±0.53倍)。通过对启动子中trans-factor结合位点进行预测,与-634~+100 bp截短片段相比,-881~+100 bp截短片段含有一个已知的低温调控元件(BCL6的结合位点),进一步证实了BCL6的结合位点在低温条件下,可以诱导下游基因显著表达。总之,低温冷诱导ciarta启动子的筛选可以作为研究鱼类低温下分子机制的一个工具来诱导基因在低温下的表达。
【关键词】:斑马鱼 低温胁迫 顺式调控元件 cirata BCL6
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q78
【目录】:
  • 摘要4-6
  • abstract6-10
  • 第一章 引言10-14
  • 1.1 顺式调控元件简介10-11
  • 1.1.1 启动子、增强子和沉默子10-11
  • 1.1.2 增强子和沉默子作用机制11
  • 1.2 植物中温度诱导的cis-element11-12
  • 1.3 鱼类低温响应顺式调控元件的研究12-13
  • 1.4 顺式调控元件的预测和功能鉴定13-14
  • 第二章 斑马鱼低温响应顺式调控元件的功能鉴定14-25
  • 2.1 前言14-15
  • 2.2 材料和方法15-19
  • 2.2.1 材料15-16
  • 2.2.2 方法16-19
  • 2.2.2.1 斑马鱼基因组DNA提取16
  • 2.2.2.2 gstp1、ubc、apoba基因启动子目的片段扩增16-17
  • 2.2.2.3 基于Tol2转座子的EGFP报告基因载体构建17-18
  • 2.2.2.4 重组质粒启动子顺式调控元件的突变18
  • 2.2.2.5 斑马鱼胚胎显微注射和低温处理18
  • 2.2.2.6 斑马鱼卵RNA提取18-19
  • 2.2.2.7 RNA的反转录和荧光定量PCR19
  • 2.2.2.8 定量结果分析19
  • 2.3 结果19-24
  • 2.3.1 gstp1、ubc、apoba基因启动子目的片段扩增结果19-20
  • 2.3.2 Tol2转座子重组质粒的构建及突变20-21
  • 2.3.3 绿色荧光鱼卵低温处理的结果21-22
  • 2.3.4 egfp基因mRNA水平上的表达变化22-24
  • 2.4 讨论24-25
  • 第三章 斑马鱼ciarta基因启动子低温诱导核心区域的鉴定25-37
  • 3.1 前言25-26
  • 3.2 材料与方法26-29
  • 3.2.1 材料26
  • 3.2.2 方法26-29
  • 3.2.2.1 斑马鱼基因组DNA的提取26-27
  • 3.2.2.2 ciarta启动子生物信息学分析和截短27
  • 3.2.2.3 引物设计与合成27
  • 3.2.2.4 ciarta基因启动子的扩增27
  • 3.2.2.5 荧光素酶报告基因载体的构建27-28
  • 3.2.2.6 细胞培养、转染及低温处理28
  • 3.2.2.7 ZF4细胞RNA的提取28-29
  • 3.2.2.8 RNA的反转录和荧光定量PCR29
  • 3.2.2.9 定量结果分析29
  • 3.3 结果29-35
  • 3.3.1 ciarta基因启动子生物信息学分析和截短29-31
  • 3.3.2 ciarta启动子截短片段PCR扩增结果31-32
  • 3.3.3 构建荧光素酶报告基因重组质粒32-33
  • 3.3.4 pGL4.10重组质粒转染ZF4细胞及定量PCR33-35
  • 3.4 讨论35-37
  • 第四章 结论与展望37-38
  • 参考文献38-46
  • 致谢46

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