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《上海海洋大学》 2016年
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miR-202在斑马鱼胚胎发育过程中起重要的调控功能

许彦娜  
【摘要】:miRNA是长度约为22个核苷酸的内源性非编码RNA分子,在基因的表达调控中起重要作用。现已表明,miRNA介导着诸多生理、病理以及发育过程。斑马鱼作为脊椎动物中的模式生物,在发育生物学的研究中具有诸多优势,例如个体小,高繁殖率,生长周期短,已破译的全基因组序列以及完善的胚胎和遗传学操作技术等,这些优势使得斑马鱼成为研究miRNA的功能、胚胎发育机制和生物进化方面的实验材料。我们实验室在早期研究工作中发现miR-202是let-7家族成员,在脊椎动物物种间具有高度保守性,但是在脊索动物门文昌鱼的基因组中却未发现该miRNA,预示着miR-202可能在脊椎动物中具有特殊功能。尽管有报道miR-202在性腺中特异性表达,但miR-202在斑马鱼胚胎发育过程中的调控功能却尚未揭示。因此,我们以脊椎动物模型—斑马鱼为实验材料,以期了解miR-202在斑马鱼早期胚胎发育过程中的调控功能,进而揭示其在生命发生及生物进化方面的重要意义。首先利用q RT-PCR技术和整体原位杂交技术(WISH)探究miR-202在斑马鱼早期胚胎发育过程中的时空表达。结果发现,miR-202在斑马鱼胚胎0 hpf-72 hpf发育阶段持续性表达。其次,采用反义核苷酸阻断miR-202的表达,发现斑马鱼胚胎发育停滞在4 hpf左右,并且最终死亡。将miR-202的反义核苷酸与前体共注射于斑马鱼胚胎能够部分挽救由敲降miR-202所引起的胚胎发育异常。最后,利用前沿的CRISPR/Cas9基因编辑技术对斑马鱼miR-202编码序列进行片段删除。结果发现F1代杂合子斑马鱼与野生型对照组斑马鱼胚胎发育过程无明显差异。但是miR-202敲除的F2代纯合子斑马鱼胚胎在受精后5 hpf-24 hpf内相继死亡。本实验初步证实了miR-202在斑马鱼早期胚胎发育过程中的至关重要的调控作用,而其分子调控机制有待进一步的深入研究。
【关键词】:斑马鱼胚胎发育 miR-202 qRT-PCR WISH CRISPR/Cas9系统
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q954.4
【目录】:
  • 摘要4-5
  • ABSTRACT5-9
  • 第一章 引言9-21
  • 1.1 miRNA9-13
  • 1.1.1 miRNA概述9-10
  • 1.1.2 miRNA的作用机制10-12
  • 1.1.3 miRNA研究方法12-13
  • 1.2 miRNA在斑马鱼中的研究13-15
  • 1.2.1 miRNA在斑马鱼早期胚胎发育中的研究13-14
  • 1.2.2 miRNA在斑马鱼其他组织发育中的研究14-15
  • 1.3 miR-202的研究现状15-16
  • 1.3.1 miR-202在哺乳动物中的研究15
  • 1.3.2 miR-202在脊椎动物中的研究15-16
  • 1.4 CRISPR/Cas9系统16-19
  • 1.4.1 CRISPR/Cas9系统概述16-18
  • 1.4.2 CRISPR/Cas9系统的应用研究进展18-19
  • 1.5 本研究的主要内容和意义19-21
  • 第二章 材料与方法21-37
  • 2.1 引言21
  • 2.2 实验材料21
  • 2.3 仪器和试剂21-24
  • 2.3.1 实验仪器21-22
  • 2.3.2 所用各种试剂、试剂盒及缓冲液22-24
  • 2.4 方法和步骤24-37
  • 2.4.1 生物信息学方法24
  • 2.4.2 斑马鱼受精卵显微注射24-25
  • 2.4.3 miR-202反义核苷酸抑制及挽救25-26
  • 2.4.4 miRNA分离和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)26-27
  • 2.4.5 CRISPR/Cas9系统敲除miR-20227-35
  • 2.4.6 斑马鱼胚胎整体原位杂交35-37
  • 第三章 结果与讨论37-53
  • 3.1 斑马鱼早期胚胎发育过程中miR-202的表达量变化37-38
  • 3.1.1 利用qRT-PCR检测各时期miR-202的表达量变化37
  • 3.1.2 利用整体原位杂交检测斑马鱼各个时期miR-202的表达37-38
  • 3.2 利用反义核苷酸抑制斑马鱼受精卵miR-20238-40
  • 3.3 斑马鱼受精卵中过表达miR-20240-41
  • 3.4 斑马鱼胚胎挽救实验41-42
  • 3.5 CRISPR/Cas9系统定点突变斑马鱼miR-20242-44
  • 3.6 CRISPR/Cas9系统片段敲除斑马鱼miR-20244-50
  • 3.6.1 获得TS1、TS2、TS3靶点的sgRNA44-45
  • 3.6.2 检测各靶点的有效性45-46
  • 3.6.3 检测并筛选F0代杂合突变体46-48
  • 3.6.4 检测F1代胚胎发育48
  • 3.6.5 检测F2代纯合突变体及表型48-50
  • 3.6.6 利用斑马鱼整体原位杂交检测miR-202表达量变化50
  • 3.7 讨论50-53
  • 参考文献53-62
  • 致谢62

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