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《上海海洋大学》 2016年
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低温胁迫对ROS产生、MAPK和Selenoprotein P功能的影响

许琼琼  
【摘要】:温度作为影响生物分布的重要因素之一,直接决定了生物体的生理特征和行为。鱼类作为最广泛分布的脊椎动物,其如何来适应温度变化一直以来是环境生物学的一个研究热点。在之前的研究中,通过对南极鱼亚目的南极鱼和温带硬骨鱼类进行转录组和基因组比较分析,发现与活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)代谢和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路相关的蛋白在南极鱼中表达量显著上调;具有抗氧化作用的硒蛋白(Selenoprotein P,sepp1)在南极鱼基因组上大量扩增。为了进一步研究低温作用下分子调控机制以及其与ROS之间的关系,本研究对斑马鱼胚胎成纤维ZF4细胞和人宫颈癌HeLa细胞进行不同强度(ZF4细胞:18℃和10℃,HeLa细胞:28℃和18℃)和不同时间(1d、3 d和5 d)的低温胁迫,利用DCFH-DA探针法监测ROS的变化以及western blot检测MAPK通路中蛋白和Selenoprotein P的表达情况。结果如下:1)低温胁迫诱使两种细胞生长速度变慢。在ZF4细胞10℃和HeLa细胞18℃处理5 d的时候,显微镜下明显观察到细胞破损和脱落,细胞活力监测也有相同的结果。2)低温胁迫处理后,两种细胞内ROS含量增加,呈现出不同的变化趋势。在ZF4细胞中,细胞内ROS上升水平与低温胁迫压力成正相关关系。低温处理3 d后,18℃和10℃的细胞,其ROS含量与对照组(28℃)相比分别显著升高到1.23±0.04倍(P0.05)和2.31±0.08倍(P0.05)。在HeLa细胞中,细胞内ROS含量呈现先升后降的趋势,在3 d达到最高:在28℃和18℃的细胞,其ROS含量与对照组(37℃)相比分别显著升高到10.51±2.90倍(P0.05)和15.03±1.33倍(P0.05)。而且,用NAC处理以后,低温下两种细胞的ROS都发生降低。3)Western blot检测细胞中磷酸化的p38(p-p38)、磷酸化的JNK(p-JNK p54和p-JNK p46)和磷酸化的ERK(p-p44/42)的水平变化。在ZF4细胞中,两种强度的低温胁迫(18℃和10℃)都可以使p38和JNK的活性增强,且均在10℃处理3d达到最高水平,但是p44/42的活性在低温下反而减弱了;在HeLa细胞中,p38和JNK仅在18℃低温处理下被激活,呈现出不同时间表达特征:JNK的活性在1 d时被诱导,而p38的活性在3 d时被诱导。p44/42的磷酸化在两个低温作用下都被激活,且随着时间延长而表达增加。4)进一步检测DNA断裂标记蛋白γH2A.X的表达水平,结果显示:无论在ZF4细胞还是HeLa细胞中,其在第3 d呈现高表达。5)在低温处理5 d后,18℃和10℃的ZF4细胞以及28℃和18℃的HeLa细胞,其Sepp1的蛋白水平与对照组(28℃和37℃)相比都显著增加,其中两种细胞的m RNA水平也发生上调(P0.05)。总而言之,本研究通过对斑马鱼ZF4细胞和HeLa细胞的不同低温胁迫,研究不同时间点下细胞内ROS的含量以及激活的MAPKs(p-p44/42,p-JNK p54、p-JNK p46和p-p38)的表达分析。第一方面,发现ROS的含量以及MAPK和DNA损伤蛋白表达受到低温调控,在两种细胞中不同的表达模式,这为了解恒温动物和变温动物温度响应的分子机制异同提供了基础;第二方面,低温处理3 d后,两种细胞中ROS含量显著上升以及MAPK通路和DNA损伤被激活,这个低温处理的关键时间点(3 d)可以为我们以后研究低温适应的分子机制提供一个很好的切入点;第三方面,低温诱导ZF4细胞和HeLa细胞内源性Selenoprotein P蛋白的表达,这为后期Selenoprotein P的抗氧化作用奠定基础。
【关键词】:低温胁迫 ROS 斑马鱼胚胎ZF4细胞 HeLa细胞 MAPK 硒蛋白Selenoprotein P
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q494
【目录】:
  • 摘要4-6
  • ABSTRACT6-10
  • 第一章 引言10-22
  • 1.1 低温胁迫对鱼类影响10-12
  • 1.2 ROS12-17
  • 1.2.1 ROS的代谢12-13
  • 1.2.2 ROS与信号转导通路13-14
  • 1.2.3 ROS在低温诱导细胞凋亡中扮演重要的角色14-16
  • 1.2.4 在疾病、癌症和寿命长短等问题中ROS扮演重要的角色16-17
  • 1.3 MAPK通路17-18
  • 1.3.1 MAPK的组成17-18
  • 1.4 DNA损伤18-19
  • 1.5 硒蛋白P(Selenoprotein P)19-22
  • 1.5.1 Sepp1的结构和作用19-20
  • 1.5.2 Sepp1的生物合成和表达调控20-22
  • 第二章 低温胁迫对细胞ROS及MAPK相关蛋白表达的影响22-41
  • 2.1 前言22-23
  • 2.2 材料与方法23-30
  • 2.2.1 细胞23-24
  • 2.2.2 主要试剂和仪器24-26
  • 2.2.3 细胞低温处理及形态观察26
  • 2.2.4 流式细胞仪监测ROS的产生26-27
  • 2.2.5 Western Blot分析低温处理状况下蛋白的表达情况27-30
  • 2.2.6 数据统计分析30
  • 2.3 结果30-37
  • 2.3.1 低温下ZF4细胞形态和细胞活力检测30-32
  • 2.3.2 低温诱导ZF4细胞ROS产生32-33
  • 2.3.3 低温诱导ZF4细胞MAPK以及 γH2A.X的表达33-34
  • 2.3.4 HeLa细胞低温下形态和细胞活力检测34-35
  • 2.3.5 低温诱导HeLa细胞ROS产生35-37
  • 2.3.6 低温诱导HeLa细胞MAPK以及 γH2A.X的表达37
  • 2.4 讨论37-41
  • 第三章 Selenoprotein P在低温胁迫ZF4细胞和HeLa细胞中表达情况41-50
  • 3.1 前言41-42
  • 3.2 材料与方法42-45
  • 3.2.1 细胞42
  • 3.2.2 主要试剂和仪器42
  • 3.2.3 细胞低温处理及形态观察42-43
  • 3.2.4 Western Blot分析蛋白表达43
  • 3.2.5 RNA提取43
  • 3.2.6 建立cDNA43-45
  • 3.2.7 数据处理45
  • 3.3 结果与分析45-48
  • 3.3.1 低温诱导ZF4细胞Selenoprotein P的表达45-46
  • 3.3.2 低温诱导HeLa细胞Selenoprotein P的表达46
  • 3.3.3 低温处理ZF4细胞Selenoprotein P的转录水平46-47
  • 3.3.4 低温处理HeLa细胞Selenoprotein P的转录水平47-48
  • 3.4 讨论48-50
  • 第四章 结论50-51
  • 参考文献51-60
  • 致谢60

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