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《上海海洋大学》 2016年
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转vp28基因工程聚球藻的规模培养与采收

孙溢华  
【摘要】:对虾白斑综合症病毒(WSSV)于1992年首次在台湾发现,随后迅速蔓延至各大洲,对全世界的对虾养殖业造成严重的病害,经济损失超过70亿美元。国际上,尚不存在产业化的WSSV防治药物。研究发现,WSSV被膜中的特异性结构蛋白VP28在病毒侵染细胞过程中发挥关键作用,该蛋白经异源系统表达后,通过口服或注射接种,可提高对虾抗WSSV的能力。我们的研究也发现,转vp28基因工程蓝藻经对虾口服后攻毒,发现对虾在30天内能有效抵抗WSSV(成活率达70%-90%),表明已开发的工程聚球藻具有巨大的产业化前景。目前本实验室转vp28基因工程聚球藻口服剂的研制已进入实验准备阶段,其中工程聚球藻的规模培养及采收是其产业化的重要一环。我们在进行工程聚球藻规模培养中,认识到其产业化受3方面因素制约:1)目前规模培养设备及技术不成熟,生物量产量较低;2)重组蛋白表达率尚有提高的潜力;3)缺少安全快速高效的采收技术。为解决上述问题,本论文特从以下3方面进行系统研究:1.光照强度对工程聚球藻生物量的调控为提高转vp28基因工程聚球藻的生物量产量,光照强度(I)的调控依据2个因素:1)I与p H、温度的交互作用;2)I在反应器中的衰减作用。为此,本论文首先通过单因素实验,确定了当净光合速率为极大值时,I、温度及p H的交互范围,分别为200-400μmol/m2s、28-48°C、6.5-8.5;并进一步通过响应面实验测定I、p H及温度的最优交互条件,即分别为300±10μmol/m2s、37°C、7.5,此时净光合速率达到最大值,342μmol O2/mg Chlah。按照优化温度(37°C)和pH(7.5),分别于2种反应器模型(5 L/108 W外置光源模型,100 L/120W内置光源模型)中培养工程聚球藻。5 L反应器中I在培养对数期可调至250-300μmol/m2s,3 d后生物量为1.5 g/L;100 L反应器中I在培养对数期可调至180-250μmol/m2s,7 d后生物量为0.4 g/L。对100 L反应器进行改造,将灯管功率由120 W提高至300 W,同时将光源分布由3组改为6组,培养至对数期时,反应器50%区域中I达到300±10μmol/m2s,并使对数期延长36 h,7 d后生物量达到0.8 g/L。可见,I是影响光生物反应器最终生物量的关键因素,提高I的功率能够显著增加生物量产量,使I均匀分布可显著延长生长对数期。2.光质对工程聚球藻重组蛋白VP28表达的影响通过改变光质可以调控工程聚球藻的生长及重组蛋白的表达。采用5 L/108 W外置光源反应器进行72 h培养,通过改变入射光中单色光的比例,检测培养过程中生物量的变化、psb A的转录、vp28的转录及VP28蛋白的相对积累量。研究发现:1)光质为50%白光、33.3%蓝光及16.7%红光时,最终vp28的表达率达到2.4%,是100%白光下的3倍;重组蛋白VP28的相对积累量提高至2倍;生物量的积累达到1.22 g/L;psb AII、psb AIII的转录得到促进。2)光质为50%白光、33.3%红光及16.7%蓝光时,最终vp28的表达率达到0.5%;10μg总蛋白中VP28的相对积累量只有高比例蓝光下的5%;psb AII及psb AIII基因的转录受到抑制,psb AI的转录得到促进;生物量积累达到1.68g/L。可见,光质可显著调控重组蛋白的表达,并对生物量产生一定影响。其中蓝光促进了重组蛋白的表达,抑制了生物量的积累,而红光与蓝光的作用相反。光质对质粒启动子的调控机制与宿主基因psb A的调控有关。3.工程聚球藻采收技术的研究为建立快速安全高效的采收技术,研究不溶性沉淀絮凝法的采收效率及安全性,主要包括3个方面:1)最适诱导剂及其剂量的确定;2)细胞悬浮液中胞外分泌物(AOM)的去除;3)絮凝后蛋白析出量控制。实验结果显示,1)在悬浮液中增加0.25 m M镁离子浓度,在p H 11条件下采收率达到90%以上。2)4000 rpm离心去除悬浮液中的AOM,采用新鲜培养液(0.3 m M镁离子)重悬,发现p H调至10.5时,采收率即达到95%以上。3)发现光质为50%白光、33.3%蓝光及16.7%红光时,悬浮液中AOM为2 mg/L以下。4)100%白光下,悬浮液AOM为4.5 mg/L左右。5)光质50%白光、33.3%红光及16.7%蓝光下,悬浮液中AOM为5 mg/L以上。6)在5°C、20°C及35°C水浴条件下,分别检测絮凝结束后上清液中的总蛋白含量,30 min后,分别为35μg/ml、24μg/ml、10μg/ml。其中,可溶性蛋白经电泳分离后,分子量大小均在20 KDa以下,经抗体检测未发现VP28条带。7)絮凝后及时调整下层藻细胞浓缩液至p H 7.5,上清液蛋白析出量为12μg/ml。可见,镁离子的絮凝效果受到AOM的严重制约,高比例蓝光可显著降低AOM的产生,高比例红光起相反效果。采收后藻细胞的蛋白损失受温度及p H影响,避免高温并及时恢复p H至藻细胞生理水平,可降低50%蛋白损失。综上我们认为,应用光生物反应器培养转vp28基因工程聚球藻时,光照强度及光质的合理调控能显著提高生物量及重组蛋白产率;改良的不溶性沉淀絮凝法可在不损伤重组蛋白的条件下,实现了工程聚球藻的快速采收。
【关键词】:聚球藻 光生物反应器 光质 VP28 絮凝 采收
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q949.2
【目录】:
  • 摘要4-7
  • ABSTRACT7-13
  • 引言13-27
  • 1 工程聚球藻13-16
  • 1.1 聚球藻13
  • 1.2 工程聚球藻的应用13-15
  • 1.3 抗WSSV口服剂的开发15-16
  • 2 微藻的规模培养16-22
  • 2.1 光生物反应器16-18
  • 2.2 光生物反应器的光调控18-20
  • 2.3 光质对生物量的影响20-22
  • 3 微藻的采收22-25
  • 3.1 微藻的采收方法22-24
  • 3.2 电荷中和分离法24-25
  • 3.3 不溶性沉淀分离法25
  • 4 本论文研究内容和意义25-27
  • 第一章 光照强度对工程聚球藻生物量的调控27-37
  • 1 材料与方法27-30
  • 1.1 藻种及培养条件27
  • 1.2 净光合作用的单因素实验27-28
  • 1.3 净光合作用的响应面实验28
  • 1.4 光生物反应器的培养条件28-29
  • 1.5 光强测定方法及调控模型29
  • 1.6 生物量的测定29-30
  • 2 结果30-35
  • 2.1 工程聚球藻的最适光合条件30-33
  • 2.2 5L模型的生物量调控33-34
  • 2.3 100L模型的生物量调控34-35
  • 3 讨论35-37
  • 第二章 光质对工程聚球藻重组蛋白VP28表达的影响37-45
  • 1 材料与方法37-39
  • 1.1 转vp28基因聚球藻的摇床培养37
  • 1.2 转vp28基因聚球藻的光生物反应器培养37-38
  • 1.3 vp28表达率的测定38
  • 1.4 VP28相对积累量的测定38-39
  • 1.5 psb A的表达分析39
  • 2 结果39-43
  • 2.1 藻细胞干生物量的积累39-40
  • 2.2 vp28基因的表达量与VP28蛋白的积累40-42
  • 2.3 psb A的表达差异42-43
  • 3 讨论43-45
  • 第三章 工程聚球藻采收技术的研究45-56
  • 1 材料与方法45-47
  • 1.1 藻种及培养条件45-46
  • 1.2 5L光生物反应器的培养46
  • 1.3 金属盐的添加46
  • 1.4 采收率的测定46
  • 1.5 镁离子的调控46-47
  • 1.6 AOM的检测47
  • 1.7 蛋白损失的检测47
  • 2 结果47-53
  • 2.1 金属盐絮凝剂的比较47-48
  • 2.2 镁离子浓度对采收率的影响48-49
  • 2.3 AOM对采收率的影响49-50
  • 2.4 光质对AOM的调控50-51
  • 2.5 藻细胞絮凝的过程观察51
  • 2.6 采收过程中蛋白损失的分析51-53
  • 3 讨论53-56
  • 结论与展望56-58
  • 参考文献58-71
  • 主要科研成绩71-72
  • 致谢72

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