收藏本站
《上海海洋大学》 2016年
加入收藏

企鹅珍珠贝葡萄糖转运蛋白1同源异构型基因的克隆及对葡萄糖应激的表达响应分析

邱萤  
【摘要】:葡萄糖转运蛋白(GLUTs)是能量代谢的关键因子,用于血液和组织间的葡萄糖转运,维持机体能量代谢,为了探索GLUT1(glucose transporter type1)在企鹅珍珠贝中的功能,本文开展了企鹅珍珠贝GLUT1的克隆与功能研究。主要结果如下:1.利用企鹅珍珠贝转录组序列数据,筛选得到两条GLUT1基因EST序列,利用RACE技术分别克隆出两条企鹅贝GLUT1基因cDNA全长,一条蛋白分子量为57kDa,并命名为PpGLUT1,另一条蛋白分子量为58kDa。GLUT1(57kDa)基因cDNA全长为2 068bp,ORF为1 569bp,5’UTR为216bp,3’UTR为276 bp。该基因编码522个氨基酸,包含一个SP功能结构域,12个跨膜螺旋区,N端和C端都在胞质侧,有多个磷酸化位点,分子量为57.2264kDa,理论等电点为5.17。该基因序列与其他物种GLUT1序列一致性为57%-72%。不同组织荧光定量结果表明,该基因在闭壳肌、肝胰腺、肠、性腺、足、外套膜和鳃中都有表达,在肠和外套膜中表达量最高,闭壳肌中的表达量显著低于其他组织。50%的高浓度葡萄糖注射闭壳肌结果表明,在注射后30min内,肠PpGLUT1表达量升高,在30min之后,表达量逐渐降低,注射2h时表达量最低,2h之后表达量略有上升。不同浓度葡萄糖注射实验表明,肠道中的PpGLUT1表达量高于对照组的表达量,当葡萄糖浓度为10%-40%时,PpGLUT1表达量逐渐上升,浓度为40%时,PpGLUT1表达量最高,40%之后,表达量逐渐降低。肠道组织的原位杂交显色结果表明PpGLUT1在肠道组织中表达量很丰富且多集中在固有层和粘膜下层(基底膜附近)等处,肌层中表达量极少。2.GLUT1(58kDa)基因cDNA cDNA全长为2 237 bp,开放阅读框为1 584bp,5’非编码区(5’UTR)为494 bp,3’UTR为159 bp,包含有29个poly A尾巴,该基因编码527个氨基酸,分子量预测为58.9388 kDa,理论等电点pI为8.16,亲水性(GRAVY)总评均值为0.542,因此该蛋白为疏水性蛋白。该蛋白共有14个Ser、1个Thr和4个Tyr磷酸化位点,5个糖基化位点(NYTF,NKTI,NKTS,NSTM和NISL),不存在信号肽序列。跨膜结构域预测表明,该基因存在12个跨膜螺旋结构域,N端和C端都在胞质侧。功能结构域分析表明,该基因氨基酸序列的84aa-500aa处具有SP(sugar porter family)特征结构域,并且还具有xylE同源结构域和AraJ(arabinose efflux permease)透膜酶结构域。多重序列比对分析表明,PpGLUT1有3个特征性保守序列(XXQQXSG,EXFXQXPR and PETKXXTFXEI),分别位于309-316aa,430-437aa and 490-500aa的氨基酸序列处,其中XXQQXSG位于跨膜螺旋区上,EXFXQXPR and PETKXXTFXEI位于胞质侧。同源性比对发现,与长牡蛎(Crassostrea gigas)的序列一致性为75%,与海蜗牛(Aplysia californica)的相似性达到83%,一致性为56%,与其他物种的比对结果表明,相似性都在36-50%,序列一致性多为58-70%,50%的高浓度葡萄糖注射实验结果显示,在注射后30 min内,GLUT1(58kDa)表达量升高;在30 min之后,表达量逐渐降低;当注射时间为2 h时,GLUT1(58kDa)表达量最低;2 h之后,表达量逐渐上升,在4h时,表达水平稳定。葡萄糖注射实验结果表明,企鹅贝在注射不同浓度葡萄糖后,肠组织中的GLUT1(58kDa)表达量都比注射前增加,当葡萄糖浓度小于0.2g/mL时,表达量依次升高;当浓度为0.2g/mL时,GLUT1(58kDa)表达量达到最高,当浓度大于0.2g/mL时,表达量逐渐降低上述结果表明,企鹅珍珠贝GLUT1(57kDa)和GLUT1(58kDa)主要在肠和外套膜表达,对葡萄糖注射有表达响应,表达量变化幅度相似,两个葡萄糖转运蛋白可能存在相互作用。
【关键词】:企鹅贝 GLUT1 基因克隆 葡萄糖
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S917.4;Q78
【目录】:
  • 摘要5-7
  • Abstract7-11
  • 第一章 文献综述11-23
  • 1 企鹅珍珠贝简介及研究现状11-17
  • 1.1.企鹅珍珠贝简介11
  • 1.2.企鹅珍珠贝研究现状11-17
  • 1.2.1.企鹅珍珠贝的养殖现状11-15
  • 1.2.1.1 企鹅贝的生物学特性11-12
  • 1.2.1.2 企鹅贝繁育、育珠现状12-14
  • 1.2.1.2.1 企鹅珍珠贝繁育进展12-13
  • 1.2.1.2.2 企鹅珍珠贝的养成研究13
  • 1.2.1.2.3 企鹅珍珠贝育珠进展13-14
  • 1.2.1.3 环境对企鹅贝培育的影响14-15
  • 1.2.2.企鹅贝在分子水平上的研究进展15-17
  • 1.2.2.1.企鹅贝遗传育种研究现状15-16
  • 1.2.2.2.有关企鹅贝基因克隆的研究16-17
  • 2 GLUTs基因简介与研究进展17-20
  • 2.1 GLUTs基因简介17
  • 2.2 GLUTs基因各亚型研究进展17-20
  • 3 GLUT1基因20-22
  • 3.1 GLUT1简介及研究进展20-21
  • 3.2 GLUT1在不同物种中的研究21-22
  • 4 本研究的目的及意义22-23
  • 第二章 企鹅珍珠贝GLUT1(57kDa)和GLUT1(58kDa)基因的克隆23-51
  • 1.企鹅珍珠贝GLUT1(57kDa)和GLUT1(58kDa)基因的克隆24-36
  • 1.1 实验材料及仪器24
  • 1.1.1 样本材料24
  • 1.1.2 实验试剂24
  • 1.1.3 主要实验仪器24
  • 1.2 试剂配制24-25
  • 1.3 EST序列筛选及序列验证25-31
  • 1.3.1 EST序列筛选25
  • 1.3.2 序列验证25-31
  • 1.4 3’RACE扩增31-35
  • 1.4.1 3’RACE引物设计31-32
  • 1.4.2 3’RACE反转录产物制备32-33
  • 1.4.3 3’RACE PCR反应33-35
  • 1.5 序列分析35-36
  • 2 GLUT1(57kDa)基因克隆结果36-42
  • 2.1 EST序列验证结果36
  • 2.2 3’RACE扩增结果36-38
  • 2.3 序列拼接及分析38-41
  • 2.4 PpGLUT1分子进化树分析41-42
  • 3 GLUT1(58kDa)基因克隆结果42-49
  • 3.1 EST序列验证结果42-43
  • 3.2 3’RACE扩增结果43-44
  • 3.3 序列拼接及分析44-48
  • 3.4 GLUT1(58kDa)分子进化树分析48-49
  • 4 讨论49-51
  • 第三章 企鹅珍珠贝GLUT1(57kDa)和GLUT1(58kDa)基因的表达分析51-58
  • 1 荧光定量组织表达51-53
  • 1.1 实验材料51
  • 1.2 荧光定量引物51-52
  • 1.3 总RNA提取52
  • 1.4 荧光定量反转录制备52-53
  • 1.5 荧光定量PCR反应53
  • 2 GLUT1对葡萄糖应激的响应53-54
  • 3 表达分析及对葡萄糖响应的结果54-57
  • 3.1 PpGLUT1 mRNA表达分析54-55
  • 3.1.1 PpGLUT1 mRNA在不同组织中的相对表达量54
  • 3.1.2 葡萄糖应激响应结果54-55
  • 3.2 GLUT1(58kDa)表达分析55-57
  • 3.2.1 GLUT1(58kDa)在不同组织中的相对表达量55-56
  • 3.2.2 葡萄糖应激响应结果56-57
  • 4 讨论57-58
  • 第四章 小结与展望58-59
  • 小结58
  • 展望58-59
  • 参考文献59-65
  • 附录1 缩略词表65-66
  • 附录2 硕士期间发表的论文和参加的会议66-67
  • 致谢67

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 赵小刚,安娟;葡萄糖转运蛋白的研究进展[J];饲料工业;2005年14期
2 张增伟;葡萄糖转运蛋白4在细胞中的生理作用研究进展[J];实用诊断与治疗杂志;2005年03期
3 滕彩华;邓尚平;;葡萄糖转运蛋白[J];国外医学(内分泌学分册);1993年04期
4 李颖健,刘志红,刘栋,章精,陈朝红,黎磊石;人肾小球系膜细胞葡萄糖转运蛋白的鉴定及功能研究(英文)[J];Chinese Medical Journal;2001年08期
5 段艳芳;;葡萄糖转运蛋白细菌同源体的晶体结构[J];自然杂志;2013年01期
6 李颖健,刘志红,章精,陈朝红,黎磊石;人肾小球系膜细胞葡萄糖转运蛋白的研究[J];细胞生物学杂志;1999年04期
7 ;清华大学首次解析葡萄糖转运蛋白晶体结构[J];科学24小时;2014年09期
8 方晨;;敲开葡萄糖转运之门[J];科学世界;2014年08期
9 关秋华,刘德惠;葡萄糖转运蛋白与2型糖尿病[J];中国实验动物学杂志;2000年03期
10 程振起,许卫东,蒋五玲,汪清胤,黄永芬;大鼠小肠壁细胞葡萄糖转运蛋白一级结构及功能的研究[J];中国科学(B辑 化学 生命科学 地学);1991年10期
中国重要会议论文全文数据库 前9条
1 张娜;李庆章;高学军;;奶山羊乳腺发育过程中葡萄糖转运蛋白1的检测[A];2008年全国生物化学与分子生物学学术大会论文摘要[C];2008年
2 孔德贤;王超;甘可欣;聂倩;张雪梅;宋光耀;;线粒体融合蛋白2对大鼠骨骼肌葡萄糖转运蛋白4转位及表达调节机制的研究[A];中华医学会糖尿病学分会第十六次全国学术会议论文集[C];2012年
3 辛颖;王志超;张丽华;龙秀荣;;低血糖幼鼠脑内葡萄糖转运蛋白1、3表达的变化及意义探讨[A];2006年中华医学会糖尿病分会第十次全国糖尿病学术会议论文集[C];2006年
4 林晓仪;丁鹤林;;高糖对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖转运蛋白1表达的影响[A];2006年中华医学会糖尿病分会第十次全国糖尿病学术会议论文集[C];2006年
5 童珊珊;闵苏;魏珂;张光新;;体外循环对兔骨骼肌葡萄糖转运蛋白4和胰岛葡萄糖转运蛋白2的影响[A];第十五次长江流域麻醉学学术年会暨2010年中南六省麻醉学学术年会暨2010年湖北省麻醉学学术年会论文集[C];2010年
6 杜宏;唐政;陈朝红;赵明;刘志红;;葡萄糖转运蛋白1基因多态性与糖尿病肾病患者预后的关系[A];2006年中华医学会糖尿病分会第十次全国糖尿病学术会议论文集[C];2006年
7 黄颂敏;赖学莉;杜新;;高糖和胰岛素对肾小球系膜细胞葡萄糖转运蛋白4表达及易位的影响[A];中华医学会肾脏病学分会2006年学术年会论文集[C];2006年
8 鲍江;林海;;长期应激对家禽骨骼肌葡萄糖转运蛋白的影响[A];中国家禽科学研究进展——第十四次全国家禽科学学术讨论会论文集[C];2009年
9 马聪;侯海;占艺;徐涛;;猪脂肪中GLUT4的大量提取、纯化以及Western检测[A];第十次中国生物物理学术大会论文摘要集[C];2006年
中国重要报纸全文数据库 前4条
1 记者 白毅;我学者首次揭示人源葡萄糖转运蛋白1晶体结构[N];中国医药报;2014年
2 沈金凤;糠尿病康复不妨饭后走[N];医药养生保健报;2006年
3 南方日报驻京记者 王腾腾;饿死癌细胞[N];南方日报;2014年
4 记者 林莉君;清华新成果有望定向“饿死”癌细胞[N];科技日报;2014年
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 陈粤;葡萄糖转运蛋白在大鼠睾丸中的表达及其调控研究[D];厦门大学;2004年
2 周东雷;胃肠道重建影响糖尿病大鼠葡萄糖转运蛋白表达的机理研究[D];第二军医大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前6条
1 李英梅;生发基质—脑室内出血对早产兔脑组织葡萄糖转运蛋白的影响[D];河北医科大学;2015年
2 邱萤;企鹅珍珠贝葡萄糖转运蛋白1同源异构型基因的克隆及对葡萄糖应激的表达响应分析[D];上海海洋大学;2016年
3 刘雯;4-苯基丁酸对成肌细胞葡萄糖转运蛋白基因表达的影响[D];哈尔滨工业大学;2012年
4 王泽彬;血管紧张素II对肾小球足细胞葡萄糖转运蛋白1的表达及易位的影响[D];广州医学院;2009年
5 钟秀君;葡萄糖转运蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义[D];浙江大学;2006年
6 方芳;过表达葡萄糖转运蛋白-2基因的INS-1细胞构建研究[D];第三军医大学;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026