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《上海海洋大学》 2016年
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腌干鱼加工过程微生物群落多样性分析及产胺菌的控制技术研究

钱茜茜  
【摘要】:腌干鱼在南方饮食文化中有着悠久历史,因其制作简单,风味独特,耐贮藏,深受大众青睐。腌干鱼的加工过程是一个由多种微生物主导的过程,微生物的种属、数量与腌干鱼制品品质、风味和营养等密切相关。肌肉组织中富有多种微生物,在加工体系中形成独特的微生物群落结构,腌干鱼加工体系中的微生物在腌制体系中的生长存在方式、演替规律、与乳酸菌种群的关系及其相互作用对腌干鱼加工如何产生效应,至今国内外尚没有系统、深入的研究。此外,这些微生物在加工过程和贮藏过程中不可避免的产生生物胺,而生物胺含量超标问题又是限制水产品加工产业的重要问题。因此,本文探究了腌干鱼加工体系中微生物群落变化并开展了与生物胺形成相关微生物鉴定的研究,同时,也分析比较了食品添加剂、植物提取物和微生物助剂三种添加物对咸鱼中的产胺微生物和生物胺的抑制效果。为腌干鱼腌制机制、质量控制及低生物胺含量工艺的建立提供理论依据。1、本文采用宏基因组技术,研究了腌干鱼在不同加工阶段的细菌多样性,结果表明:整个加工体系微生物种类丰富,主要分为三大类:拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变性菌门(Proteobacteria);蓝圆鲹初始菌相中优势细菌为肠杆菌科(Enterbacteriaceae)、肠球菌科(Enterococcactae)、假单胞菌科(pseudomonadaceae)和希瓦氏菌科(shewanellaceae),传统腌制加工过程中菌相比较单一,优势菌主要是弧菌科(vibrionaceae)、葡萄球菌科(staphylococcaceae)、假单胞菌科(pseudomonadaceae)和动性球菌科(planococcaceae);而接种乳酸菌发酵后,加工过程中细菌多样性呈现增加趋势,并且乳酸菌成为优势菌,促进了exiguobacteracea,葡萄球菌(staphylococcaceae)等优势菌的繁殖。此外还检测到气单胞菌(aeromonadaceae)和乳杆菌(lactobacillaceae)等传统蓝圆鲹腌制加工过程中没有出现的菌。海鲈在腌制加工过程中细菌多样性明显高于蓝圆鲹,新鲜海鲈中初始菌相中优势菌主要是气单胞菌科(aeromonadaceae)、芽孢杆菌科(bacillaceae)、葡萄球菌科(staphylococcaceae)、丛毛单胞菌科(comamonadaceae)、肠杆菌科(enterbacteriaceae)、肠球菌科(enterococcaceae)、摩式摩根菌科(moraganellaceae)、链球菌科(streptococcaceae)等,乳酸菌辅助腌制加工过程中细菌多样性也略有增加。2、为进一步确认影响腌干鱼加工过程中生物胺产生的菌种,本文采用选择培养基和hplc技术分离出产生物胺的细菌,并对确认的产胺菌进行菌种鉴定及产胺能力分析,结果表明:蓝圆鲹在传统腌制加工过程中的优势产胺菌为嗜水气单胞菌、犬巴斯德菌和解藻朊酸弧菌。沙门菌群的产腐胺、尸胺和酪胺能力最强(p0.05),嗜水气单胞菌的产组胺能力最强(p0.05);在乳酸菌辅助腌制加工过程中的优势产胺菌为嗜水气单胞菌、解藻朊酸弧菌和少动鞘氨醇单胞菌。杀鲑气单胞菌具有最强的产腐胺和组胺能力(P0.05),沙门菌群的产尸胺和酪胺能力最强(P0.05)。海鲈在传统腌制加工过程中的优势产胺菌为解藻朊酸弧菌、格氏乳球菌和溶血葡萄球菌。格氏乳球菌的产腐胺和尸胺量最高(P0.05),沃氏葡萄球菌的产组胺量最高(P0.05),溶血葡萄球菌的产酪胺量最高(P0.05)。在乳酸菌辅助腌制加工过程中的优势产胺菌为嗜水气单胞菌、阴沟肠杆菌和松鼠葡萄球菌。阴沟肠杆菌的产腐胺能力最强(P0.05),嗜水气单胞菌的产尸胺和组胺能力最强(P0.05),弗氏柠檬酸杆菌产酪胺能力最强(P0.05)。3、研究了腌制过程温度、pH值和食盐浓度等因素对产胺菌的生长和产生物胺能力的影响。结果表明:温度和食盐浓度的变化对高产胺菌的生长和产生物胺能力有较大影响,低温可以有效抑制生物胺的产生。100~200g/L的盐度对产胺菌株也有明显的抑制作用,100 g/L的盐度可以抑制组胺的产生,200 g/L的盐度才可以抑制腐胺、尸胺和酪胺的形成。因此可利用适当的低温和高食盐浓度来抑制生物胺产生。4、分析比较了山梨酸钾、姜辣素和乳酸菌混合物三种添加物对腌干鱼中的产胺微生物和生物胺的抑制效果,结果表明:300mg/kg姜辣素抑制产胺微生物的效果最好,贮藏结束时与空白组对比,腐胺、尸胺和组胺含量分别降低了46.91%、39.96%和76.75%;山梨酸钾和乳酸菌对腐胺、尸胺和组胺有一定的抑制效果,但不及姜辣素;三种添加物对酪胺均有一定的抑制效果。因此,综合考虑选择300mg/kg姜辣素应用于腌干鱼的生产加工。
【关键词】:腌干鱼 宏基因组技术 微生物多样性 产胺微生物 抑制
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:TS254.4;TS201.3
【目录】:
  • 摘要4-7
  • Abstract7-15
  • 引言15-17
  • 第一章 文献综述17-25
  • 1.1 腌干鱼制品的概况17-18
  • 1.2 鱼类腌制品中微生物的分布与多样性研究现状18-19
  • 1.2.1 传统腌制鱼中的微生物多样性18-19
  • 1.2.2 微生物发酵辅助腌制鱼中微生物多样性19
  • 1.3 腌制食品中微生物群落多样性研究技术19-20
  • 1.4 产生物胺微生物的研究进展20-22
  • 1.4.1 产生物胺微生物20-22
  • 1.4.1.1 乳酸菌20-21
  • 1.4.1.2 肠杆菌21
  • 1.4.1.3 微球菌21
  • 1.4.1.4 其他微生物21-22
  • 1.4.2 产生物胺微生物的检测与控制22
  • 1.5 立题依据及研究内容22-25
  • 1.5.1 立题依据22-23
  • 1.5.2 研究内容23
  • 1.5.3 技术路线23-25
  • 第二章 腌干鱼加工过程中微生物群落多样性分析25-42
  • 2.1 引言25-26
  • 2.2 实验材料、试剂与仪器26
  • 2.2.1 实验材料26
  • 2.2.2 实验试剂26
  • 2.2.3 仪器设备26
  • 2.3 实验方法26-30
  • 2.3.1 腌干鱼制品加工方法26-27
  • 2.3.1.1 传统法26-27
  • 2.3.1.2 乳酸菌辅助法[27]27
  • 2.3.2 取样方法27
  • 2.3.3 分组信息27-28
  • 2.3.4 细菌总DNA的提取28-29
  • 2.3.5 16SrDNA V4片段的PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳29-30
  • 2.3.6 MiSeq测序及数据分析30
  • 2.4 结果与分析30-39
  • 2.4.1 α-多样性分析30-32
  • 2.4.2 OUT PCA分析32-34
  • 2.4.3 OUT韦恩图分析34-37
  • 2.4.4 微生物群落结构变化37-38
  • 2.4.5 物种系统进化分析38-39
  • 2.5 讨论39-40
  • 2.6 本章小结40-42
  • 第三章 腌干鱼加工过程产生物胺菌的分离鉴定及生物学特性研究42-61
  • 第一节 腌干鱼加工过程中产生物胺菌的分离鉴定42-54
  • 1.1 引言42
  • 1.2 实验材料、试剂与仪器42-44
  • 1.2.1 实验材料42-43
  • 1.2.2 实验试剂43
  • 1.2.3 仪器设备43-44
  • 1.3 试验方法44-46
  • 1.3.1 腌干鱼制品加工方法44
  • 1.3.2 取样方法44
  • 1.3.3 产胺菌株的初步分离与纯化44-45
  • 1.3.4 产胺菌生物胺检测45
  • 1.3.4.1 生物胺标准曲线的配制45
  • 1.3.4.2 生物胺的测定45
  • 1.3.5 产胺菌的鉴定45-46
  • 1.3.6 数据处理方法46
  • 1.4 结果与分析46-52
  • 1.4.1 生物胺标准样品的回归方程和回归系数46-47
  • 1.4.2 产胺菌的分离纯化及生物胺检测47-52
  • 1.5 讨论52-53
  • 1.6 结论53-54
  • 第二节 腌制温度、pH和盐度对产胺菌的生长和产生物胺能力的影响54-60
  • 2.1 引言54
  • 2.2 实验材料、试剂与仪器54-55
  • 2.2.1 实验材料54
  • 2.2.2 实验试剂54-55
  • 2.2.3 仪器设备55
  • 2.3 实验方法55-56
  • 2.3.1 温度对产胺菌生长和产生物胺的影响55-56
  • 2.3.2 pH对产胺菌生长和产生物胺的影响56
  • 2.3.3 NaCl浓度对产胺菌生长和产生物胺的影响56
  • 2.4 结果与讨论56-59
  • 2.4.1 温度对产胺菌生长和产生物胺的影响56-57
  • 2.4.2 pH值对产胺菌生长和产生物胺的影响57-58
  • 2.4.3 食盐浓度对产胺菌生长和产生物胺的影响58-59
  • 2.5 结论59-60
  • 本章小结60-61
  • 第四章 腌干鱼加工过程中产胺微生物的控制技术研究61-75
  • 4.1 引言61-62
  • 4.2 实验材料、试剂与仪器62-63
  • 4.2.1 实验材料62
  • 4.2.2 实验试剂62-63
  • 4.2.3 仪器设备63
  • 4.3 实验方法63-65
  • 4.3.1 单因素实验63-64
  • 4.3.1.1 山梨酸钾添加剂63
  • 4.3.1.2 姜辣素添加剂63-64
  • 4.3.2 三种添加物对生物胺的抑制效果的试验设计64
  • 4.3.3 基本工艺流程64
  • 4.3.4 产生物胺微生物的测定64
  • 4.3.5 生物胺含量测定64-65
  • 4.3.5.1 生物胺标准曲线的配制64
  • 4.3.5.2 样品的处理64-65
  • 4.3.6 数据分析65
  • 4.4 结果与分析65-73
  • 4.4.1 单因素实验结果65-67
  • 4.4.1.1 山梨酸钾65-66
  • 4.4.1.2 姜辣素66-67
  • 4.4.2 三种添加物对腌干鱼中产生物胺微生物的影响67-68
  • 4.4.3 三种添加物对腌干鱼中生物胺含量的影响68-73
  • 4.4.3.1 三种添加物对腌干鱼中生物胺总含量的影响68-69
  • 4.4.3.2 三种添加物对腌干鱼中腐胺含量的影响69-70
  • 4.4.3.3 三种添加物对腌干鱼中尸胺含量的影响70-71
  • 4.4.3.4 三种添加物对腌干鱼中组胺含量的影响71-72
  • 4.4.3.5 三种添加物对腌干鱼中酪胺含量的影响72-73
  • 4.5 讨论73
  • 4.6 本章小结73-75
  • 创新点75
  • 展望75-76
  • 参考文献76-82
  • 致谢82-83
  • 攻读硕士期间发表的论文83

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