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《上海海洋大学》 2016年
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抑制HMG-CoA还原酶海洋微生物代谢产物的初步研究

孟哓琴  
【摘要】:来自微生物次生代谢产生的活性化合物一直以来在人类疾病的预防和治疗过程中发挥着至关重要的作用。近些年来,传统抗生素的广泛使用导致细菌的耐药性越来越强,从陆地上发现结构新颖的活性化合物已经越来越难,海洋微生物越来越受到科研工作者的重视。但是人们对海洋微生物的营养需求和代谢活动还知之甚少,所以选择和设计合适的培养基和培养条件对海洋微生物的分离具有巨大意义。把握合适的培养基和培养条件能使海洋微生物充分被利用来产出结构新颖且活性优良的天然产物。初步发现海洋腐皮镰刀菌FG319(Fusarium solani FG319)的一种次生代谢产物MFS有显著的抑制HMG-CoA还原酶的作用,优化了腐皮镰刀菌FG319的培养条件和提取分离条件,分离得到MFS并对其生物活性作用特性和结构特征进行了初步研究。第一章综述了3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA,HMG-CoA)还原酶抑制剂即他汀类药物从第一代美伐他汀一直到最新的瑞舒伐他汀的发展历程以及它具有抑制HMG-CoA还原酶、稳定和逆转动脉粥样硬化斑块、抑制平滑肌细胞迁移和增生作用、调节内皮及血管舒缩功能等重要的药理作用。本文就是以提高HMG-CoA还原酶抑制剂的产量为目标,对海洋腐皮镰刀菌FG319培养条件和提取分离条件进行初步优化,以期获得成分单一具有良好活性的化合物,并对其结构特性进行研究初步探索。第二章对海洋腐皮镰刀菌FG319小规模摇床培养研究发现腐皮镰刀菌FG319的发酵液在培养5天内pH基本趋于不变,在第5天发酵结束后对发酵液进行代谢产物的提取,提取物在271nm有最大紫外吸收峰。随着腐皮镰刀菌FG319甲醇粗提物添加浓度的升高,其对HMG-CoA还原酶的抑制率也越大,当代谢粗提物的浓度为150μg/mL时,抑制率最高且为80%。将粗提物进行初步分离纯化得到MFS(Metabolite of Fusarium solani FG319)对HMG-CoA还原酶的抑制活性最显著,IC50为9.08±1.38 mg/m L。第三章以提高海洋微生物腐皮镰刀菌FG319产出HMG-CoA还原酶抑制剂MFS的数量为目标,优化摇瓶发酵培养基和培养条件,基于摇瓶条件设置发酵罐发酵参数获得mfs。使用gsb培养基、cym培养基、atcc培养基、bpy培养基、tyg培养基、oa培养基、cd培养基、pdb培养基,基于摇瓶发酵条件优化发酵罐发酵参数。海洋微生物腐皮镰刀菌fg319的最佳培养基为cd培养基,发酵第7天hmg-coa还原酶抑制剂mfs的产量达到最大,诱导物l-鸟氨酸盐酸盐提高了4.07倍mfs的产出量,全糖型、ph=6.9、不添加nacl时海洋微生物腐皮镰刀菌fg319发酵罐发酵产出mfs的数量达到23.47mg/l。通过培养基选择和发酵条件优化,显著提高了海洋微生物腐皮镰刀菌fg319发酵罐发酵产出hmg-coa还原酶抑制剂的数量。第四章对菌株fg319发酵培养发酵液经甲醇超声浸提,二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇按照极性由小到大的顺序逐次萃取,只有二氯甲烷萃取的粗提物在271nm(=7.6×104)处有最大吸收峰。二氯甲烷有机相在hplc分析36.65min时对应tlc板中rf=0.58拖尾的位置是目标活性产物mfs。二氯甲烷萃取的粗提物通过tlc点板比较,选择纯氯仿作为洗脱剂。洗脱后tlc点板合并项拖尾点3含有目标活性产物mfs。进一步确定了在甲醇:50mmol/l醋酸铵=70:30为流动相,采用岛津scl-10avphplc分离系统对二氯甲烷粗提物进行精制,分离得到菌株fg319次生代谢产物中具有抑制hmg-coa还原酶的活性化合物。从1lfg319发酵培养液得到精制的活性化合物为23.47mg。第五章发现来源于海洋腐皮镰刀菌fg319的代谢产物mfs通过建立体外抑制hmg-coa还原酶模型,以洛伐他汀和普伐他汀作为阳性对照,从hmg-coa还原酶抑制活性比较,海洋真菌镰刀腐皮菌fg319次生代谢产物mfs的活性约是洛伐他汀活性的1.38倍,是普伐他汀活性的1.74倍,其对hmg-coa还原酶的抑制机理判定为可逆抑制。底物hmg-coa与mfs的抑制类型是竞争性抑制,底物nadph与mfs的抑制类型表现为反竞争性抑制,说明mfs能抑制hmg-coa还原酶活性,减少甲羟戊酸的生成,而甲羟戊酸是人体内源性胆固醇合成的前体,这样有利于防止和治疗由as引起的心脑血管疾病的发生。第六章对制备所得的活性化合物mfs进行了结构特征参数分析,通过其esi-ms质谱、紫外光谱、核磁共振谱(1h-nmr、13c-nmr)等,确定该化合物的分子量为719,在271nm有最大吸收波长,典型氢谱信号δh是0.866(13h,m)、1.138(7h,m)、1.257(10h,m)、1.302(4h,m)、1.345(5h,m)、1.163(6h,m)、2.029(6h,m)、2.342(6h,t,j=7.33hz)、2.770(1h,t,j=6.41hz)、4.130(1h,m)、5.344(4h,m)。化合物典型碳信号δc分别是14.06、14.11、22.59、22.70、24.69、25.65、27.18、27.20、27.23、29.05、29.08、29.16、29.25、29.34、29.38、29.45、29.54、29.61、29.66、29.69、29.70、29.72、29.79、31.55、31.95、34.10、127.93、128.10、129.74、130.03、130.22、180.29、180.33。初步推测该化合物属于大环内脂类化合物。初步研究海洋腐皮镰刀菌FG319的发酵罐优化培养条件,探索其次生代谢产物MFS的分离纯化工艺,研究MFS体外抑制HMG-CoA还原酶的活性及对MFS结构特征参数进行分析,并初步推测该化合物属于大环内脂类化合物。从体外研究表明,海洋腐皮镰刀菌FG319次生代谢产物MFS可抑制HMG-CoA还原酶活性,减缓内源性胆固醇前体甲羟戊酸的生成,从而减少胆固醇的合成,有利于防止心脑血管疾病的发生。有望成为一种新型的用于预防和治疗动脉粥样硬化等心脑血管疾病的先导化合物。
【关键词】:腐皮镰刀菌FG319 MFS HMG-CoA还原酶抑制剂 培养条件 结构特征参数
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:TS201.3
【目录】:
  • 摘要4-7
  • ABSTRACT7-14
  • 第一章 引言14-22
  • 1.1 HMG-CoA还原酶抑制剂的发展史15-18
  • 1.1.1 他汀类药物15-18
  • 1.1.2 HMG-CoA还原酶抑制剂 1233A18
  • 1.1.3 海洋腐皮镰刀菌FG319次级代谢产物18
  • 1.2 他汀类药物降脂作用机理 [17]18-19
  • 1.3 他汀类调脂药的药理作用19-21
  • 1.3.1 抑制HMG-CoA还原酶19
  • 1.3.2 稳定和逆转动脉粥样硬化斑块19
  • 1.3.3 抑制平滑肌细胞迁移和增生作用19-20
  • 1.3.4 调节内皮及血管舒缩功能20
  • 1.3.5 其他作用20-21
  • 1.4 结语21-22
  • 第二章 海洋腐皮镰刀菌FG319小规模摇床培养与次生代谢产物的活性初筛22-30
  • 2.1 材料与方法23-25
  • 2.1.1 实验材料23
  • 2.1.2 方法23-25
  • 2.2 结果与分析25-29
  • 2.2.1 腐皮镰刀菌FG319代谢产物的性质研究25-27
  • 2.2.2 腐皮镰刀菌FG319粗提物对HMG-CoA还原酶的影响27-28
  • 2.2.3 腐皮镰刀菌FG319粗提物的分离与精制28-29
  • 2.3 结论29-30
  • 第三章 海洋腐皮镰刀菌FG319产出HMG-CoA还原酶抑制剂的初步发酵优化30-39
  • 3.1 材料与方法30-33
  • 3.1.1 实验材料30-32
  • 3.1.2 实验方法32-33
  • 3.2 结果与分析33-38
  • 3.2.1 不同培养基发酵腐皮镰刀菌FG319产生MFS的特性33-35
  • 3.2.2 L-鸟氨酸盐酸盐对发酵腐皮镰刀菌FG319产生MFS的影响35-36
  • 3.2.3 发酵培养基的优化36-37
  • 3.2.4 存在诱导物L-鸟氨酸盐酸盐时对镰刀腐皮菌FG319发酵生长曲线的确定37-38
  • 3.3 结论38-39
  • 第四章 海洋腐皮镰刀菌FG319产出HMG-CoA还原酶抑制剂的分离纯化39-48
  • 4.1 材料与方法40-42
  • 4.1.1 实验材料40
  • 4.1.2 实验方法40-42
  • 4.2 结果与分析42-46
  • 4.2.1 次生代谢产物的提取42-44
  • 4.2.2 活性化合物的分离44-46
  • 4.3 结论与讨论46-48
  • 第五章 HMG-CoA还原酶抑制剂MFS酶促动力学研究48-54
  • 5.1 材料与方法48-49
  • 5.1.1 实验材料48
  • 5.1.2 实验仪器48-49
  • 5.1.3 实验方法49
  • 5.2 结果与分析49-53
  • 5.2.1 镰刀腐皮菌FG319次生代谢产物HMG-CoA还原酶抑制剂的活性评价49-50
  • 5.2.2 MFS对HMG-Co A还原酶抑制机理的判定50-51
  • 5.2.3 MFS对HMG-Co A还原酶抑制类型的判定51-53
  • 5.3 结论与讨论53-54
  • 第六章 海洋腐皮镰刀菌FG319产出HMG-CoA还原酶抑制剂的结构研究54-59
  • 6.1 材料与方法54-55
  • 6.1.1 实验材料54
  • 6.1.2 实验方法54-55
  • 6.2 结果与分析55-58
  • 6.2.1 质谱分析结果55-56
  • 6.2.2 紫外图谱分析56
  • 6.2.3 核磁共振图谱分析56-58
  • 6.3 结论58-59
  • 总结59-61
  • 参考文献61-68
  • 致谢68-69
  • 个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果69

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