收藏本站
《上海海洋大学》 2016年
加入收藏

毕赤酵母异源表达来自于Yersinia rohdei植酸酶及其酶学特性的分析

陈磊  
【摘要】:植酸即肌醇六磷酸及植酸盐普遍分布于植物组织和农作物产品中,占植物机体总重的的1-3%,其中植酸形式的磷含量占作物总磷含量的60-90%,是植物中磷元素和肌醇的主要贮存形式。植酸盐也可与蛋白质类形成配合物,植酸形式的磷不但不能被单胃动物所消化利用,而且还是一种抗营养因子会抑制多种营养成分的吸收和利用。在真菌、细菌等微生物和动植物中均有发现有能水解植酸的生物酶,植酸酶即环己醇六磷酸水解酶具备催化分解环己醇六磷酸及其金属盐形式的化合物并生成环己醇与磷酸盐的一类磷酸单酯水解酶,是HAP(Histidine Acid Phosphatase)的超级家族。植酸酶可让饲料中植酸形式的磷元素利用率提高百分之六十,粪便中的磷元素排出量减少百分之四十。不仅减少动物粪磷对地表水等环境的污染,而且能够降解植酸盐的抗营养作用,增加单胃动物对多肽段和一些矿物质元素的消化吸收。因此这些对增加畜牧生产效益及减少其对环境的污染有重要意义。由于大多数植酸酶在原始菌株中表达较低,而且酶学特性不够突出不适合大规模工业生产,利用基因工程菌毕赤酵母(Pichia pastoris)GS-115菌株作为宿主系统以提高植酸酶的产量成为现在普遍采用的方式。毕赤酵母真核表达系统相对于原核表达系统,具备高表达量、发酵工艺成熟、分泌表达目的产物,不形成难复性的内涵体,且易于分离纯化等优势,目前已成功的应用在很多外源基因的表达研究方面。pAOX1(Alcohol oxidase promoter 1,)是毕赤酵母表达中应用最多的启动子,其甲醇诱导性很强,可用来驱动外源目的基因的分泌表达。毕赤酵母表达系统具有很高的生物安全性,已获得包括美国FDA在内的广泛认可。毕赤酵母GS-115菌株细胞自身产生很少量的其他蛋白,易于异源分泌蛋白的分离和纯化,适应于高密度细胞发酵培养,且其分泌的目的蛋白存在转录后翻译加工修饰,使其更接近于自然存在的蛋白结构和酶活,因此是比较合适地微生物表达系统。本研究中,根据NCBI数据库公布的Yersinia rohdei的植酸酶基因序列(GenBank Accession No:ABU98779),按照巴斯德毕赤酵母的密码子偏爱,优化目的基因序列,通过PTDS方法合成了Yersinia rohdei植酸酶基因(YrAPPA)。将载有目的基因的重组表达载体YR3345,电击转化到甲醇型毕赤酵母GS115菌株体内进行分泌表达,通过后期的钒-钼黄分光光度法活性鉴定、SDS-PAGE等方法,获得能够过量表达YrAPPA植酸酶阳性酵母菌株。阳性毕赤酵母重组菌株进行扩大培养和甲醇诱导表达,将粗酶液经镍柱纯化后进行相关酶学特性和动力学参数等的实验研究。结果表明:重组植酸酶的Km和Vmax值分别为0.37 mg/mL和6410μmol min-1mg~(-1),该酶相对分子量为47 KDa。该酶的最适温度和pH分别为55℃和4.5;2mmol/L的金属离子和化学试剂对Yr APPA植酸酶的研究发现Zn~(2+)、Fe~(3+)和Cu~(2+)对植酸酶活性有抑制作用,而Mg~(2+)、Cr~(3+)、Co~(2+)和Ni+等离子对酶的抑制仅有百分之十几,对酶活影响不大。在不同pH值子缓冲液下37℃温育3 h后,重组植酸酶剩余酶活在pH 3-7.5范围中相对酶活均在60%以上,pH的范围比较宽偏酸和弱碱性,有很好的适应性;YrAPPA植酸酶的温度稳定性是在各种温度下温育0.5 h后测得剩余酶活,在60℃温育10-30 min之间后相对酶活比较稳定,相对酶活均在40%左右,而在65和70℃相对酶活却在20%左右;所以60℃时酶稳定性要比65和70℃高;胃蛋白酶和胰蛋白酶对YrAPPA植酸酶均表现为抑制趋势,重组YrAPPA植酸酶对胰蛋白酶的抑制作用比较稳定而胰蛋白酶对重组YrAPPA植酸酶的抑制作用变化幅度比较大。近年来,重组植酸酶被广泛作为添加剂应用于饲料工业中,需要能高水平分泌表达且易于产物分离纯化的表达系统。但自然产生植酸酶的菌株表达量和酶活低,难以获得大量产品,不利于大规模商业化生产。利用毕赤酵母高效的表达系统作为生物反应宿主菌,能大规模、高密度的发酵产生高酶活性的重组YrAPPA植酸酶并降低生产成本。本实验第一次将Yersinia rohdei植酸酶基因在毕赤酵母中转化表达,获取比较热稳定和宽pH范围的重组YrAPPA植酸酶。综上所述,这些研究为重组Yr APPA植酸酶工业化生产和应用提供了一种潜在的选择。
【关键词】:植酸酶 耶尔森氏菌 毕赤酵母 酶学特性 钒-钼黄分光光度法
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q78;Q55
【目录】:
  • 摘要3-5
  • ABSTRACT5-8
  • 缩略词表8-11
  • 引言11-32
  • 1 植酸酶的研究进展11-24
  • 1.1 植酸11-14
  • 1.1.1 植酸理化特性11-12
  • 1.1.2 植酸抗营养作用12-14
  • 1.2 植酸酶的研究进展14-24
  • 1.2.1 植酸酶作用机制14-15
  • 1.2.2 植酸酶分类15-22
  • 1.2.3 植酸酶的应用22-24
  • 2 毕赤酵母表达系统应用前景24-30
  • 2.1 微生物表达系统24-25
  • 2.2 毕赤酵母表达系统的特点25-30
  • 2.2.1 宿主菌株类型26-27
  • 2.2.2 表达载体27-30
  • 3 研究目的、意义和内容30-32
  • 3.1 研究目的和意义30-31
  • 3.2 研究方案流程31-32
  • 第一章 YrAPPA基因的合成与测序32-46
  • 1 实验材料和方法32-42
  • 1.1 实验材料32-34
  • 1.1.1 菌株和质粒32-33
  • 1.1.2 试剂盒和生化试剂33
  • 1.1.3 主要仪器和培养基33-34
  • 1.2 试验方法34-39
  • 1.2.1 密码子优化和引物合成34-37
  • 1.2.2 PCR 扩增合成目的基因37-38
  • 1.2.3 DNA胶回收38-39
  • 1.3 重组表达载体的构建及测序39-42
  • 1.3.1 T载体克隆和测序39-42
  • 1.3.1.1 T载体克隆39-40
  • 1.3.1.2 大肠杆菌(DH5α)感受态的制备40
  • 1.3.1.3 重组T载体转化大肠杆菌40-41
  • 1.3.1.4 质粒抽提41-42
  • 1.3.1.5 重组质粒酶切鉴定42
  • 1.3.1.6 测序42
  • 2 结果分析42-45
  • 2.1 DNA合成和测序42-43
  • 2.2 序列比对43-45
  • 3 讨论45-46
  • 第二章 YrAPPA基因在毕赤酵母中诱导表达和分离纯化46-58
  • 1 实验材料和方法46-55
  • 1.1 实验材料46-48
  • 1.1.2 菌株和质粒46-47
  • 1.1.3 生化试剂和主要仪器47
  • 1.1.4 培养基和其他溶液47-48
  • 1.2 实验方法48-55
  • 1.2.1 重组表达载体的构建48-50
  • 1.2.2 电击转化表达毕赤酵母50-52
  • 1.2.2.1 重组表达载体线性化50
  • 1.2.2.2 毕赤酵母感受态的制备50-51
  • 1.2.2.3 电击转化毕赤酵母51
  • 1.2.2.4 阳性转化子筛选51-52
  • 1.2.3 重组植酸酶的分泌表达和分离纯化52-53
  • 1.2.4 SDS-PAGE鉴定和蛋白含量测定53-55
  • 1.2.4.1 SDS-PAGE鉴定53-54
  • 1.2.4.2 蛋白含量测定54-55
  • 2 结果分析55-57
  • 2.1 YrAPPA基因转化和异源表达55
  • 2.2 SDS-PAGE和蛋白含量的测定55-57
  • 3 讨论57-58
  • 第三章 YrAPPA植酸酶的酶学特性的研究和对比58-67
  • 1 材料和方法58-62
  • 1.1 实验材料58-59
  • 1.1.1 生化试剂和主要仪器58-59
  • 1.1.2 溶液配方59
  • 1.2 实验方法59-62
  • 1.2.1 酶活的测定59-60
  • 1.2.2 重组YrAPPA植酸酶酶促动力反应学参数的测定60
  • 1.2.3 重组YrAPPA植酸酶的最适反应温度和温度稳定性60-61
  • 1.2.4 重组植酸酶的最适 p H 和 p H 稳定性研究61
  • 1.2.5 金属离子对YrAPPA植酸酶活性的作用61
  • 1.2.6 两种消化蛋白酶对YrAPPA重组植酸酶活性的作用61-62
  • 2 结果分析62-66
  • 2.1 Yr APPA植酸酶酶促动力反应学参数62
  • 2.2 重组植酸酶最适温度和热稳定62-64
  • 2.3 重组植酸酶最适pH和pH稳定性64
  • 2.4 不同金属离子对Yr APPA植酸酶活性的作用64-65
  • 2.5 消化蛋白酶对YrAPPA植酸酶活性的作用65-66
  • 3 讨论66-67
  • 本文结论和创新点67-68
  • 参考文献68-73
  • 附录73-76
  • 硕士期间发表的文章76-77
  • 致谢77

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 鲁晓岩;植酸酶的研究进展[J];北方园艺;2002年05期
2 杨平平,许正宏,王燕,陶文沂;微生物植酸酶研究进展[J];微生物学通报;2004年03期
3 代发文;周响艳;李富伟;;植酸酶在饲料中的应用研究进展[J];饲料工业;2007年04期
4 杜丽敏;段相林;;植酸酶的来源与应用[J];安徽农业科学;2007年16期
5 王严;高晓蓉;苏乔;王静云;安利佳;;产植酸酶菌株的筛选及其植酸酶基因的克隆[J];微生物学通报;2007年04期
6 文铁桥,张扬,范崇春;植酸酶活性对种子萌发影响的研究[J];湖北大学学报(自然科学版);1993年04期
7 单安山,王安,徐奇友,石宝明,杜鹃,宋金彩,马玺,王丽娟;植酸酶的特性及其在家禽饲粮中应用的研究 1.微生物植酸酶、植物植酸酶特性的测定与影响因素的研究[J];东北农业大学学报;2001年04期
8 姚银花,谢爱纯;植酸酶及其应用[J];贵州师范大学学报(自然科学版);2003年02期
9 程海娜,莫湘涛,陈宇,夏立秋;植酸酶分子结构与功能研究进展[J];生物技术;2003年03期
10 刘丽丽,杨文博,刘忠;细菌耐热植酸酶基因的克隆及表达[J];微生物学通报;2004年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张芹;滕安国;刘金银;;植酸酶在猪营养中的应用[A];饲料酶制剂的研究与应用[C];2009年
2 李成会;;蚯蚓体内植酸酶来源的研究[A];第六次全国饲料营养学术研讨会论文集[C];2010年
3 王彩虹;;植酸酶检测关键控制点[A];首届饲料酶制剂应用技术论坛暨饲料酶制剂大会论文集[C];2009年
4 王秋艳;赵维香;郭利亚;薛敏;;植酸酶特性及稳定性效果对比研究[A];首届饲料酶制剂应用技术论坛暨饲料酶制剂大会论文集[C];2009年
5 李路胜;冯定远;左建军;;植酸酶的生产及应用研究进展[A];酶制剂在饲料工业中的应用[C];2005年
6 郭丽;王娇娇;肖凯;;植物植酸酶的生化特征和转基因表达植酸酶的研究进展[A];作物逆境生理研究进展——中国作物生理第十次学术研讨会文集[C];2007年
7 王志红;董晓芳;佟建明;张国庆;张琪;许尚忠;;植酸酶高产菌株的诱变选育[A];第六次全国饲料营养学术研讨会论文集[C];2010年
8 王永成;;剂型对植酸酶高温季节储存稳定性的影响[A];首届饲料酶制剂应用技术论坛暨饲料酶制剂大会论文集[C];2009年
9 王修启;;植酸酶在养猪生产中的应用[A];第三届全国饲料营养学术研讨会论文集[C];1998年
10 林英庭;;植酸酶在养鸡生产中的应用[A];家禽研究最新进展——第十一次全国家禽学术讨论会论文集[C];2003年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 上海交通大学 艾晓杰 谢爱纯 金凌艳;如何充分扬植酸酶之长避之短[N];中国畜牧兽医报;2005年
2 上海交通大学 艾晓杰 谢爱纯 金凌艳;如何充分扬植酸酶之长避之短[N];中国畜牧兽医报;2005年
3 上海交通大学 艾晓杰 谢爱纯 金凌艳;如何充分扬植酸酶之长避之短[N];中国畜牧兽医报;2005年
4 上海交通大学 艾晓杰 金凌艳;植酸酶在饲料中应用的若干问题[N];中国畜牧兽医报;2005年
5 梁宝忠;植酸酶将为畜牧业年增效几十亿元[N];中国畜牧兽医报;2007年
6 钟燕平;富含植酸酶玉米研制成功[N];农民日报;2007年
7 浙江省农业科学院 许尧兴;畜禽饲料中使用植酸酶应持慎重态度[N];中国畜牧报;2004年
8 ;高活性植酸酶[N];中国畜牧兽医报;2007年
9 王梅;我国研制成功富含植酸酶的玉米品种[N];中国食品质量报;2007年
10 王坚毅;植酸酶——值得大力推广的酶制剂[N];中国畜牧水产报;2001年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李晓宇;海洋酵母Kodamaea ohmeri BG3植酸酶的生产、分离纯化、基因克隆及表达的研究[D];中国海洋大学;2008年
2 王严;曲霉植酸酶基因的克隆及其表达研究[D];大连理工大学;2007年
3 王志红;醋糟及其发酵产物对蛋鸡的影响和不同品种牛瘤胃中产植酸酶菌株的筛选[D];中国农业科学院;2013年
4 王斯佳;植酸酶和低蛋白日粮对肉鸡生长性能和氮、磷利用率的影响[D];中国农业科学院;2015年
5 王志红;无花果曲霉利用醋糟产植酸酶发酵条件与植酸酶分离纯化及性质的研究[D];中国农业科学院;2009年
6 宋金彩;微生物植酸酶特殊性的研究及其在蛋鸡饲粮中的应用[D];东北农业大学;2000年
7 谷维娜;四个肠杆菌植酸酶基因的克隆、表达及性质研究[D];中国农业科学院;2007年
8 朱忠珂;固态发酵植酸酶、溶菌酶对肉仔鸡及仔猪的应用研究[D];西北农林科技大学;2008年
9 付石军;中性植酸酶产生菌的筛选及基因工程菌的构建[D];浙江大学;2008年
10 孙宏选;高剂量植酸酶对肉鸡生产性能及能量和蛋白质养分利用率的影响[D];中国农业科学院;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 黄添孙;植酸酶产酶条件及其基因克隆表达研究[D];福建农林大学;2008年
2 刘林;植酸酶基因在Pichia pastoris中的表达及发酵条件初步优化[D];山东大学;2009年
3 张蕊;天牛肠道细菌来源植酸酶的基因克隆、表达及其性质研究[D];中国农业科学院;2011年
4 李春明;几种微生物植酸酶的分离纯化及其酶学性质研究[D];西南农业大学;2005年
5 宋耿云;植酸酶构象稳定性与催化活性的关系及抑制动力学研究[D];山东农业大学;2005年
6 唐辉桂;植酸酶高效生产菌株74~#的改良[D];中国农业科学院;2008年
7 王红建;植酸酶辅助加工对大豆分离蛋白理化、功能特性的影响研究[D];江南大学;2015年
8 唐小波;一株产植酸酶芽孢杆菌对肉鸡生长性能和粪磷、粪钙排出量的影响[D];四川农业大学;2013年
9 孙国庆;植酸酶对不同钙磷含量母猪日粮中养分表观消化率和断奶窝重的影响[D];沈阳农业大学;2016年
10 潘文;1-21日龄麒麟鸡非植酸磷需要量及其植酸酶利用研究[D];广东海洋大学;2016年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026