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《上海海洋大学》 2017年
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卵形鲳鲹Fads2去饱和酶与Elovl5延长酶基因特征与功能研究

孙潇潇  
【摘要】:一般认为海水鱼类的长链多不饱和脂肪酸(Long chain polyunsaturated fatty acid,LC-PUFA)合成能力缺乏或较弱,需在其配合饲料中添加富含多不饱和脂肪酸的鱼油才能满足其正常生理功能的需求。但目前鱼油资源紧缺,价格昂贵,急需寻找来替代鱼油的其他油源。植物油中含大量C18 PUFA,是目前发现的一种较有潜力的鱼油替代品,但植物油中的LC-PUFA含量极少,成为制约植物油替代鱼油关键因素。研究表明黄斑篮子鱼、塞内加尔鳎、泰国鳢等海水鱼具有将亚油酸和亚麻酸转化为LC-PUFA的能力,但不同海水鱼类的转化能力存在显著差异。卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)是我国华南沿海最重要的海水养殖鱼类之一,其肉质鲜美,脂肪及蛋白含量高,是优质的海水食用鱼。目前卵形鲳鲹LC-PUFA合成过程及其分子调控机制还不清楚,弄清卵形鲳鲹LC-PUFA合成代谢的分子调控机制,提高其利用植物油的能力,可为卵形鲳鲹人工配合饲料的研制提供参考依据,促进卵形鲳鲹人工配合饲料中鱼油替代研究,降低饲料成本。本研究克隆了卵形鲳鲹合成LC-PUFA的关键酶脂肪酸去饱和酶2(Fatty acid desaturases,Fads2)和脂肪酸碳链延长酶5(Elongation of very long chain fatty acids protein 5,Elovl5)的基因,分析了其在不同组织中的表达特征,研究了不同饵料类型对Fads2和Elovl5 mRNA的表达调控规律,利用酵母异源表达研究了Fads2和Elovl5功能。取得的主要结果如下:1.不同饵料对卵形鲳鲹肌肉脂肪酸组成的影响。以平均体重为146.22±3.26g的健康卵形鲳鲹幼鱼为研究对象,开展了颗粒饲料、冰鲜鱿鱼(中国枪乌贼)、冰鲜杂鱼(竹荚鱼)3种饵料类型定量投喂卵形鲳鲹试验,分析了不同饵料对卵形鲳鲹生长、肌肉脂肪酸组成的影响。结果显示在相同投喂量的情况下颗粒饲料可显著促进卵形鲳鲹生长,降低饲料系数。3种投喂饵料中,冰鲜鱿鱼中的LC-PUFA含量最高;颗粒饲料中LA和ALA含量最高。3个实验组中,鱿鱼组卵形鲳鲹肌肉中LC-PUFA含量最高(P0.05),颗粒饲料组肌肉中的单不饱和脂肪酸含量较高,杂鱼组肌肉中各不饱和脂肪酸含量处于中间水平。由此可见,卵形鲳鲹肌肉LC-PUFA含量受投喂饲料的脂肪酸水平影响。2.Fads2和Elovl5基因结构和表达调控。Fads2可以特异性地在碳链上的特定位置引入双键而产生去饱和作用。本实验克隆得到Fads2 cDNA全长2215bp,开放阅读框编码442个氨基酸,其编码区氨基酸含Fads2家族的显著结构特征;同源性分析显示卵形鲳Fads2蛋白与硬骨鱼Δ4Fad同源性较高,达75%-80%;系统发育分析显示卵形鲳Fads2与其他物种Δ4Fad无明显聚类现象。Elovl5在LC-PUFA的生物合成,尤其是C18延伸中发挥重要作用。本实验扩增得到Elovl5 cDNA全长3770bp,开放阅读框编码294个氨基酸,其编码区氨基酸具有Elovl5家族显著结构特征;系统发育分析显示,卵形鲳鲹Elovl5与其它物种的Elovl5类似蛋白单独聚为一支;多重序列比对发现Elovl5蛋白与其它硬骨鱼的已知Elovl5蛋白具有较高的同源性(77%-95%)。组织差异表达分析表明,卵形鲳鲹Fads2及Elovl5mRNA均在脑、眼、肝脏组织中有较高表达。3个实验组T0、T6时段Fads2、Elovl5基因表达分析表明,Fads2、Elovl5在肠道组织中,T0时段在颗粒饲料组中低表达,T6时段两者在鱿鱼组中的表达量显著降低;在肝脏组织中,T0时段Fads2在杂鱼组中低表达,Elovl5在三个实验组中无显著差异,T6时段Fads2及Elovl5基因在鱿鱼组及杂鱼组中表达显著下调,说明合成关键酶Fads2、Elovl5的表达同时受到底物脂肪酸和产物脂肪酸(LC-PUFA)的调节。3.Fads2和Elovl5基因的功能研究。Fads2和Elovl5功能的验证采用的是酵母异源表达技术。将含有目的基因的重组表达载体转化酿酒酵母,并在诱导培养基中添加目的基因可能的PUFA底物。利用气相色谱法对酿酒酵母重组子细胞中PUFA的组成进行分析,利用气质联用法对产物脂肪酸进行结构。酵母异源表达分析证实了Fads2具有Δ4去饱和酶的功能,Elovl5具有对C18和C20碳链延长的功能,对n-3系底物脂肪酸20:5n-3的亲和力大于n-6系底物20:4n-6。
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S917.4

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