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《上海海洋大学》 2018年
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养殖对虾的病毒宏基因组分析及虾血细胞虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridescent virus,SHIV)的分子流行病学研究

邱亮  
【摘要】:对虾是世界水产养殖业当中重要的经济品种,是深受消费者喜爱的高品质水产品。尤其是在一些沿海发展中国家,对虾养殖既提供了国民生存所需的基本蛋白源,又创造了巨大的经济效益。而对虾养殖在我国同样具有重要的地位,早在上世纪七十年代,我国便开展了中国对虾的人工育苗工作,八十年代形成规模化的养殖,在经历了虾病大爆发后引进了凡纳滨对虾,之后稳步提升,到现在我国已经成为世界上最大的对虾养殖国家,海水养殖面积达到23万公顷,育苗超过1万亿尾。但即便如此,我国每年仍需进口大量对虾来满足国内的消费需求。而1993年以后,病害问题层出不穷,已知病原的持续传播,新发疫病的频繁暴发,屡屡给产业带来严重的损失,使产业和养殖环境面临巨大的挑战。而对虾的病毒病因其发病迅速,传播能力强,宿主宽泛,又无明确的防治办法,对产业的影响尤为严重。新发病原因为生物学特性、感染方式的不确定,同时因为传统病毒学研究手段的局限,给新病原的及时发现与防控带来了极大的挑战。对于未知病毒的挖掘,目前只能依靠电子显微镜的观察,这种通过形态观察来辨别新病毒的方式难度较大,准确性差。即使观测到病毒颗粒,也无法准确判断病毒的分类,难以得到病毒的核酸序列,给进一步的研究带来困难。病毒宏基因组学是研究病毒组成的一种新技术,在病毒(已知或未知)的及时发现与动态监测等方面具有突出的优势。此技术已经在人类医学,兽医领域以及一些水产鱼类上得到了应用,但对虾病害的研究当中却鲜有相关报道。本文首次对国内发病的养殖对虾样品进行病毒宏基因组学的处理和测序,探究发病对虾样品中病毒的组成情况。从测序数据中挖掘出疑似致病性的对虾病毒,并针对单个病毒进行病原的分离鉴定,探究新病毒与对虾病症的关系。同时,调查新病毒的感染和流行情况,为对虾养殖业中这些未知病原的防控提供理论基础。2014-2015年间,采集了国内七批发病的对虾样品,经OIE推荐和文章报道的PCR/RT-PCR方法检测,无与发病症状对应的病原检出。为进一步探究发病对虾中潜在的病原,对七批对虾样品进行了病毒组提纯、病毒组核酸的提取、RNA的反转录、DNA的锚定引物锚定和第二条链的合成、SISPA-PCR扩增、Illumina Hi Seq 2500宏基因组测序和数据拼接注释。经处理后的样品测序数据中,注释到病毒的reads数约占各样品总数据的25%-80%。注释到的病毒中,ds DNA病毒占78.7%,ss DNA病毒占17%,RNA病毒仅占4%。其中,S2样品中有50%以上的reads注释到虹彩病毒科,S6样品中有70%以上的reads注释到细小病毒科,其余样品中各病毒科组成较为相近,其中疱疹净病毒科reads数均占比最高。对S2样品中含量最高的虹彩病毒科reads,S1和S3样品中含量最高的疱疹病毒科reads,S3样品中含量最高的一株噬菌体reads,以及S7样品中含量最高的Decapod penstyldensovirus 1的reads进行提取拼接和PCR验证。其中虹彩病毒科reads经拼接后,获得643条序列片段,长度10,223bp-100bp,其中的一条长6,655bp片段的4个区域均通过PCR进行了验证。疱疹病毒科的reads经拼接后,获得992条序列片段,长度1,828bp-100bp,其中两条最长的片段的3个区域均通过PCR进行了验证。此外,通过数据的提取和拼接,还获得了S3样品中一株噬菌体Vibrio phage VP93的全序列,长43,640bp;以及S7样品中病毒Decapod penstyldensovirus1的全序列,长4,062bp。这是国内首次通过病毒宏基因组学技术分析养殖对虾样品的病毒组成,挖掘出了虹彩病毒,疱疹病毒等可疑的病毒序列并经过了PCR的验证,这些病毒物种极有可能是养殖对虾的潜在病原,应引起产业的重视。S2(编号20141215)样品病毒组数据中,虹彩病毒科的序列占比高,获得的拼接序列较多,极有可能存在未被报道过的潜在病原。本批样品自2014年12月15日采集自浙江省的一个对虾养殖场中,发病对虾出现生长缓慢,肝胰腺色浅萎缩,大量死亡等症状。对固定的对虾样品头胸部进行组织病理切片和H-E染色,发现造血组织、鳃丝、肝胰腺血窦和附肢等部位的细胞出现了核固缩现象,同时细胞质内存在嗜碱性包涵体,这些病理症状在之前报道的虾病中未曾出现过。通过对拼接的序列进行BLASTX比对,我们获得了一株疑似虹彩病毒的MCP基因序列和部分ATP酶序列。基于MCP和ATP酶基因序列与虹彩病毒科同源物种进行进化树分析,发现此病毒处于虹彩病毒科的一个新的分支,不属于已经划分的5个病毒属。进一步通过病毒颗粒的粗提以及组织的超薄切片,透射电镜观察发现感染对虾组织中存在大量大颗粒的二十面体病毒,其角对角直径为158.6±12.5nm(n=30),边对边直径为143.6±10.8nm(n=30),病毒内有一个直径85.8±6.0nm(n=30)的内核。而通过模拟自然的非侵入性方式和肌肉注射方式进行人工感染实验,发现均可以复制出原始样品的症状,且造成健康对虾感染15天后100%的死亡。通过超薄切片的观察确定,此病毒感染虾的血淋巴细胞,且有大量病毒游离于组织的血窦中。进一步对拼接的DNA序列进行PCR验证和一代测序填补,获得了长为165,809bp的全基因组序列。其基因组的G+C含量占34.6%,经Dot plot分析,最长重复序列长320bp,此外还有一些直接、反向和回文重复序列存在。共预测有170个ORF,102个是正向,68个是反向,共有11对ORF存在相互重叠,有63个ORF通过比对预测出了相应的基因功能,包括ATP酶,DNA聚合酶和MCP蛋白等。分别通过27个基因和16个基因的多基因进化树比对,发现本株虹彩病毒属于Iridoviridae的一个新的病毒属。基于以上结果,本文发现并鉴定了一种感染凡纳滨对虾的新型虹彩病毒,暂命名为虾血细胞虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridescent virus,SHIV),并建议将其划分到一个新的病毒属—虾虹彩病毒属Xiairidovirus。通过对人工感染SHIV的凡纳滨对虾进行血淋巴液的采集,血细胞的离心去除,滤膜的过滤,高速离心粗提。粗提液经蔗糖密度梯度离心后,离心管中出现四条肉眼可见的条带,分别分布在30%,40%和50%区域内。其中条带3最浓,分布区域也最集中。对离心管各位置的悬液进行OD280和浮力密度的测定,得出吸光度和浮力密度曲线,其中吸光度曲线有4个波峰与条带相对应,4个波峰处的浮力密度分别为1.07g/cm3,1.17 g/cm3,1.23 g/cm3和1.32 g/cm3。经过磷钨酸负染和透射电镜观察发现,条带3中SHIV病毒颗粒最密集,病毒颗粒呈典型的二十面体,核衣壳内部能观察到内界膜和核心。将纯化的条带3处悬液进行SDSPAGE,染色和脱色后,得到20条肉眼可见的蛋白条带,大小从180k Da至20k Da左右。对20个条带分别进行切胶和蛋白质谱分析比对,获得了各个条带的比对注释结果,其中包含宿主凡纳滨对虾的血蓝蛋白和SHIV的MCP蛋白等。通过以上实验,证明了纯化得到的病毒颗粒即是测序数据中拼接得到的SHIV。针对SHIV的MCP基因序列,设计原位杂交探针,对原始样品及人工感染样品进行原位杂交验证,结果在造血组织、鳃丝、肝胰腺血窦和附肢中均发现了蓝色的杂交信号,证实了SHIV在对虾体内的感染,同时确定了其感染部位。根据ATP酶基因设计引物,建立了特异性的高灵敏度套式PCR检测方法,检测极限可以达到36fg感染对虾的总DNA。与本实验室建立的荧光定量PCR方法进行检测比对,建立的套式PCR方法的检测灵敏度为97.6%,检测特异性为98.3%。应用此套式PCR检测方法对国内养殖对虾样品进行SHIV的检测调查,发现除凡纳滨对虾外,养殖中国对虾和罗氏沼虾也检测到SHIV阳性,所有样品总阳性率达到15.8%。其中阳性样品在河北省,山东省,浙江省和广东省分布较广泛,可见此病原已在国内沿海养殖场广泛传播。
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