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《上海海洋大学》 2018年
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海七鳃鳗(Petromyzon marinus)嗅觉受体与配体关系鉴定及其功能研究

张哲  
【摘要】:海七鳃鳗(Petromyzon marinus)是现存最古老的无颌类脊椎动物之一,其嗅觉系统灵敏发达,参与多种对海七鳃鳗生存至关重要的行为,如觅食、迁徙和繁殖等。海七鳃鳗具有已报道的最小的脊椎动物嗅觉受体家族,包括气味分子受体(odorant receptor,OR)、痕量胺相关受体(trace amine-associated receptor,TAAR)和犁鼻器受体1型(vomeronasal type 1 receptor,V1R)。本研究通过筛选系统,鉴定海七鳃鳗嗅觉受体与配体关系。并利用分子生物学和细胞药理学手段,阐释海七鳃鳗嗅觉受体与配体的作用机制,主要研究结果如下:1.筛选鉴定海七鳃鳗嗅觉受体与配体对应关系从海七鳃鳗基因组重新鉴定海七鳃鳗嗅觉受体基因,注释40个ORs、31个TAARs和3个V1Rs,其中成功克隆32个ORs、26个TAARs和3个V1Rs。利用HEK293T细胞系,建立海七鳃鳗嗅觉受体异源表达系统,共有46个嗅觉受体可以在HEK293T细胞膜上表达。通过建立包括氨基酸、胆盐等104种气味分子的化合物库,利用基于c AMP响应元件的萤火虫荧光素酶(CRE-luciferase)报告基因系统,筛选这46个能够膜表达的海七鳃鳗嗅觉受体的配体。结果发现海七鳃鳗性信息素3k PZS(3-keto-petromyzonol sulfate)及类似物可激活OR320a和OR320b;痕量胺中精胺(spermine)、酪胺(tyramine)、苯乙胺(phenylethylamine)和β-苯乙胺(β-phenylethylamine)可激活TAAR348;另外发现,在无刺激条件下,TAAR365等嗅觉受体呈现固有活性。2.海七鳃鳗性信息素3k PZS与其同源受体OR320a和OR320b的相互作用用CRE-lusiferase系统进一步确定,发现3k PZS只能激活OR320a和OR320b,OR320a和OR320b只对3k PZS及类似物有反应,说明OR320a和OR320b是3k PZS的特异性同源嗅觉受体。而细胞内c AMP浓度检测实验,也进一步说明3k PZS通过细胞内c AMP信号通路激活OR320a和OR320b。在OR320a和OR320b与20种3k PZS类似物的构效关系(structure activity relationship,SAR)分析中,归纳出碳3、碳7、碳12和碳24位的优势官能团分别为-OH、OSO3、-OH和-OSO3。同时具备这四个优势官能团的3k PZS类似物,C1(Petromyzonol 7,24-disulfate)是OR320a和OR320b的完全激动剂。另外,OR320b对配体的反应均弱于OR320a,尤其OR320b对碳12位为-OSO3的3k PZS类似物的弱反应,与OR320a对同组类似物的强反应形成鲜明对比。利用跨膜区重组和定点突变,发现位于受体TM2(the second transmembrane domain)的第79位氨基酸残基通过影响受体对配体的亲和力,决定了OR320a和OR320b功能不同。OR320a和OR320b与3k PZS的受体与配体关系,是目前鉴定的第一对脊椎动物甾醇类性信息素同源受体配体对。3.海七鳃鳗与东北七鳃鳗的精胺受体Pm TAAR348与Lm TAAR348的功能比较通过CRE-luciferase报告基因系统鉴定,痕量胺中精胺、酪胺和β-苯乙胺均可激活海七鳃鳗TAAR348(Pm TAAR348)。在CRE-luciferase和c AMP检测的剂量依赖实验中,只有精胺可以特异性激活Pm TAAR348,说明Pm TAAR348与精胺之间存在特异性同源受体与配体关系。我们的结果揭示了做为脊椎动物气味分子的精胺的嗅觉受体。另外,生活在中国的陆封型七鳃鳗,东北七鳃鳗(Lethenteron morii)也含有TAAR348(Lm TAAR348)。Lm TAAR348对精胺的反应强于Pm TAAR348,且是高固有活性嗅觉受体,而Pm TAAR348不是。利用定点突变的方法,发现位于受体碳端(C-terminal)的第340位氨基酸残基是决定Lm TAAR348和Pm TAAR348固有活性不同的关键位点。据此推测,东北七鳃鳗也可以识别精胺,但是产生的行为可能与海七鳃鳗不同。4.海七鳃鳗高固有活性嗅觉受体的功能研究在无任何刺激的条件下,检测海七鳃鳗嗅觉受体的本底信号,发现7个海七鳃鳗固有活性嗅觉受体,分别是5904.OR327、6425.OR330A、3721.TAAR365、7446.TAAR346A、9665.TAAR351、9755.TAAR355B和9755.TAAR355A。与小鼠的固有活性嗅觉受体一致,这些受体的固有活性不依赖Golf蛋白(嗅觉型G蛋白),猜测这些受体参与调控海七鳃鳗嗅觉受体神经元的投射。为验证此猜测,我们从固有活性最高之一的嗅觉受体TAAR365着手,用细胞免疫荧光化学和共聚焦显微镜观察在1ng/μl的转染浓度下转染48 h后,表达TAAR365的HEK293T细胞,发现该细胞的伪足伸长、变多、变细,与相邻表达TAAR365的细胞伪足融合连接。相反,表达没有固有活性的海七鳃鳗嗅觉受体OR331的细胞,在与TAAR365表达量相同的情况下,形态未发生改变。我们的结果说明海七鳃鳗固有活性嗅觉受体有改变细胞形态的能力,也推测其有参与调控嗅觉受体神经元投射的可能。最后,用CRE-luciferase系统检测,发现海七鳃鳗固有活性受体均不能被3k PZS和精胺激活,但可以被候选反向激动剂(inverse agonist)171-IDE-048-1抑制固有活性,这些结果为进一步研究海七鳃鳗固有活性嗅觉受体的功能提供了良好的基础。综合以上研究结果,本文鉴定了海七鳃鳗性信息素3k PZS的同源嗅觉受体是OR320a和OR320b,揭示第一对脊椎动物甾醇类性信息素同源受体与配体对;鉴定了海七鳃鳗痕量胺相关受体TAAR348的配体是气味分子spemine;发现海七鳃鳗固有活性嗅觉受体可以改变所在细胞的形态,推测其具有调控海七鳃鳗OSN投射的能力。总而言之,我们的结果为研究海七鳃鳗的嗅觉神经系统与运动神经系统的关系,揭示信息素的神经作用机制提供基础,为了解脊椎动物化学信号交流机制提供了有用的模型。
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q953

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