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《上海海洋大学》 2018年
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团头鲂CITED1&2基因低氧应答分析及团头鲂MSTN基因敲除的研制

孙源  
【摘要】:团头鲂(Megalobrama amblycephala),又称为武昌鱼,作为我国重要的鲤形目、鲂属、鲌亚科中的重要的代表性的淡水养殖经济物种,其生长快、成活率高、成本低等重要的优良生长特征也愈益凸显。从上个世纪60年代,就广受欢迎并日益推广养殖。团头鲂作为我国淡水养殖系统中重要的草食性经济鱼类,广受国人喜爱并成为常见的食用鱼。2016年渔业统计年鉴显示团头鲂的总产量达到70万吨。在水产养殖中,鱼类经常会遇到一些应力因素,如高温、拥挤、缺氧和细菌的侵袭,有时会造成严重的损失,此外除了外界这些可观可感的应力因素之外,也有一些生长相关的基因调控机制限制着鱼类的年产量。相对于其他常见的养殖鱼类(鲤、鲫),团头鲂具有不耐低氧的弊端,并且极易缺氧死亡给养殖产业带来损失。随着近交衰退现象的出现,使得对团头鲂更深层的探究以及应答机制的研究显得尤为重要。以求选育生长特征凸出和耐低氧的新品系团头鲂具有更大的应用价值。CITED蛋白隶属于一个无DNA结合的转录辅激物,该蛋白参与一系列的转录相应,先前文献显示CITED蛋白在哺乳动物中参与低氧应答的相应,然而在养殖鱼类中,该家族基因的分子信息以及功能信息极为匮乏。为此,该论文在不耐低氧的团头鲂中研究了CITED1和CITED2基因的分子信息及表达模式,团头鲂CITED1和CITED2基因拥有45%较低的相似度,这两个基因广泛表达于成鱼的各个组织中,在胚胎发育时期,CITED1 mRNA在4,24,28,40和44 hpf有显著的表达,然而CITED2 mRNA从受精卵到44hpf之间的表达波动较大。原位杂交显示CITED1和CITED2基因在胚胎发育到12hpf的脑部、24hpf的脑部和内脏、36hpf的脑部都有表达,此外CITED1基因在24hpf的尾部也有表达。急性缺氧实验显示低氧下团头鲂CITED1和CITED2基因在肾脏中表达显著上升、在肝脏、脑部、鳃部和心脏中表达显著下降。不同时间阶段的低氧胚胎中CITED1和CITED2基因也显著诱导。这些结果都给CITED1和CITED2基因功能的保守与分化及低氧应答等方面的研究提供新的视角。研究表明鱼类的肌纤维在整个生长过程中都会增加。调控肌肉生长的基因包括正向调控和负向调控因子。其中肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)属于TGF-β家族的成员。许多研究已证实MSTN的突变或转录表达降低能促进肌肉的生长和发育。首先团头鲂MSTNa和团头鲂MSTN b的基因序列已经获得,团头鲂MSTNa基因的全长为2195bp,编码364个氨基酸,与草鱼(71%)和斑马鱼(97%)具有很高的相似度。同样的团头鲂MSTNb基因的全长为2193,编码了375个氨基酸,并且与草鱼和斑马鱼的相似度分别为99%和97%。对团头鲂MSTNa和MSTNb基因的序列保守型及功能位点分析表明MSTN基因存在很强的进化保守性,多序列比对分析发现团头鲂MSTNa和MSTNb基因均具有TGF-β前肽结构域、RXXR蛋白酶水解位点、TGF-β或类TGF-β结构域及保守的半胱氨酸残基。本研究率先采取CAS9基因编辑技术对团头鲂MSTN基因进行敲除,根据I类和II类T7靶点的设计原则,分别在MSTNa基因的碱基序列642、1015、1232位点以及MSTNb基因的碱基序列466、878、1054位点设计靶点,Cas9/gRNA基因打靶系统由Cas9核酸酶和guide RNA(简称gRNA)构成。其中gRNA中含有主位点序列,负责识别靶基因/靶序列;Cas9负责切割靶点,造成DNA双链断裂(DSB)。在团头鲂胚胎发育到1-2细胞期时,注射gRNA(100ng/ul)和CAS9蛋白(900ng/ul),对注射的团头鲂胚胎的T7E1酶切检测结果分析汇总,筛选出效率较高的MSTNa和MSTNb的靶点,MSTNa效率较高的靶点是MSTNa-靶3-1232,酶切效率在10%左右,而MSTNb效率较高的靶点是MSTNb-靶3-1054,酶切效率在26%左右,对3月龄团头鲂子代的检测结果可知:MSTNa-靶3-1232的敲除效率为9.7%,而MSTNb-靶3-1054的敲除效率为26%。解除MSTN在团头鲂肌肉生长中的抑制,通过对后代的双肌型杂合子F1雌核发育技术和自交,筛选出优良的纯合子后代。以选育出肌肉品质更加显著的新品系,也是本研究设计的出发点和落脚点。
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S917.4

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