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《上海海洋大学》 2018年
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卵形鲳鲹生长相关基因的克隆及其对不同食物类型的表达响应

梁银银  
【摘要】:卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)是中国华南沿海最重要的海水养殖鱼类之一。“下丘脑一脑垂体一肝脏(HPL)轴”是脊椎动物生长的主要调控轴,主要通过调控多种生长相关激素的表达来促进机体细胞广泛的分裂增殖最终达到促进生长的作用。生长激素(growth hormone,GH)、生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)、胰岛素生长因子(insulin-like growth factor,IGF)是该生长轴上重要的激素,具有促进生长、提高食物转化率、促进合成代谢、调节渗透压和繁殖行为调控等生物学功能。kisspeptin在调控机体生长发育、能量代谢和生殖活动中发挥重要的作用。为了解卵形鲳鲹生长调控机制,本实验室克隆了卵形鲳鲹GH、GHRs、IGFs和Kiss四种生长相关基因,研究四种生长相关基因对不同食物类型的表达响应。依据从转录组获得的GH、GHRs、IGFs和Kiss基因片段,通过RACE技术获得以上基因的c DNA全长序列,接着进行基因生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR技术(q RT-PCR)分析基因的组织表达分布。同时基于卵形鲳鲹全基因组测序得到目的基因的基因序列,然后进行基因结构分析、启动子预测和微卫星位点预测等。基于30个野生卵形鲳鲹个体利用荧光探针技术分析微卫星位点的多态性;利用冰鱿鱼(Loligo chinensis)、冰杂鱼(即冰竹荚鱼Trachurus japonicus)和商业粒状饲料(含有36%粗蛋白)投喂卵形鲳鲹3个月,研究基因对不同饵料类型的表达响应。具体研究结果如下:(1)To GH(Genbank登陆号:MF795138)c DNA全长850 bp,编码201个氨基酸。To GH氨基酸序列有一个信号肽和两个典型的GH/SL/PRL家族保守的结构域。To GH的5’-侧翼区有多个转录因子结合位点,分别为:1个Pit-1a、3个TATA boxes、3个GRE、2个TRE、2个ERE和2个HNF-3。To GH有12个微卫星位点,经验证均无多态性。To GH基因(Genbank登陆号:MF795139)全长4.0 kb,由6个外显子5个内含子组成。To GHR1(Genbank登录号:No.MF677853)和To GHR2(Gen Bank登录号:MF677854)的开放阅读框(ORF)分别为1869 bp和1758 bp,分别编码622个和585个氨基酸。多重序列比对分析的结果表明,To GHRs与其他脊椎动物GHRs一样均具有1个高度保守的FGEFS结构域和两个保守的Boxes。To GHR1有12个微卫星位点,只有3个位点具有多态性;To GHR2有1个微卫星位点且无多态性。在To GHRs的5’侧翼序列有均有SP1、C/EBPalp、GATA-1等转录因子结合位点。To IGF1(Gen Bank登录号:MH300904)、To IGF2(Gen Bank登录号:MH300905)和To IGF3(Gen Bank登录号:MH300906)c DNA全长分别为1718bp、1658bp和2272bp,分别编码185个、215个和194个氨基酸。To IGFs氨基酸序列与其他物种一样都由5部分组成,即信号肽、B domain、C domain、A domain、D domain、E domain。To IGF1无微卫星多态性位点;To IGF2和To IGF3分别有3个和1个微卫星多态性位点。To Kiss1(Genbank登陆号:MG843840)c DNA全长505bp,可编码104个氨基酸。To Kiss1氨基酸序列有1个信号肽和1个典型的kisspeptin-10结构域。To Kiss1无微卫星多态性位点。(2)组织分布表达结果显示,To GH主要在卵形鲳鲹肠、脑和肌肉组织内的表达量较高;To GHR1在肝脏、肌肉和心脏组织中的表达量较高;To GHR2在肝脏和肌肉中表达最高;To IGF1在肝组织中表达量最高,其次为脾组织、肌肉组织和精巢;To IGF2在鳃组织中表达量最高,其次为肠、胃、脑、精巢、卵巢和肝脏;To IGF3在鳃、卵巢和精巢中表达量最高;To Kiss1的m RNA在脑中的表达量最高,其次是肠、胃、脾、肌和心。组织分布结果表明,To GH、To GHRs、To IGFs和To Kiss的组织分布不仅仅局限在与生长相关的组织如脑、肌肉和肝脏等,在生殖、渗透压调节、摄食调控相关组织也有分布,这种情况与其他硬骨鱼类的相似,这反应了To GH、To GHRs、To IGFs和To Kiss具有广泛的生物学功能,需要进一步的挖掘和利用。(3)在饵料投喂实验中,与颗粒饲料组和冰鱿鱼组相比,冰杂鱼组的肝组织内To GH m RNA的表达最高。在肠组织中,颗粒饲料组To GH m RNA表达量显著高于冰鱿鱼组(P0.05),但冰杂鱼组与其他各组均无显著差异。经三种饵料类型投喂后,To GHR1 m RNA在冰鱿鱼组肝脏中表达量最高(P0.05)。但To GHR2m RNA在冰鱿鱼组肝脏中的表达量最低(P0.05)。在肠道中,To GHR1在冰杂鱼组中表达量最高(P0.05),To GHR2在肠组织中的表达无差异显著性。经三种饵料投喂后,To IGFs在不同组织中其表达水平展现出不同的变化模式。在肝脏中,To IGF1的m RNA在冰杂鱼组和冰鱿鱼组中的表达量无明显差异,但是其在颗粒饲料组中的表达量显著高于冰杂鱼组和冰鱿鱼组。To IGF2的m RNA在颗粒饲料组中的表达量最高,其次为冰杂鱼组,在冰鱿鱼组中的表达量最低。在肠组织中,To IGF1、To IGF2和To IGF3在颗粒饲料组中均具有最高的表达量。另外,冰杂鱼组中To IGF1的表达量显著高于冰鱿鱼组中To IGF1的表达量;冰鱿鱼组中To IGF2的表达量显著高于冰杂鱼组中To IGF2的表达量;两组之间To IGF3的表达量无显著差异。经三种食物类型喂养后,在肠组织中To Kiss1基因m RNA在喂食颗粒饲料的组中表达量最高,其次为喂食冰杂鱼的组,在喂食冰鱿鱼的组中表达量最低;在肝组织中,三组之间均无显著差异。
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S917.4

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