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《上海海洋大学》 2019年
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青鳉(Oryzias latipes)sox3基因的克隆、表达分析及其相关miRNA的初步验证

浦权  
【摘要】:sox基因家族是一系列与雄性哺乳动物Y染色体上性别决定基因sry(sex determination region of Y chromosome)高度同源的基因的统称。迄今为止,在不同物种中已经发现了40余种sox基因,不同的sox基因在生物体中各自承担着重要的调控角色,包括动物的性别决定与分化过程、早期胚胎发育、早期神经系统的发育、软骨发育以及多种组织器官的形成。sox3是唯一一个定位在X染色体上的sox基因,不仅如此,sox3还是sox基因家族中与哺乳动物雄性性别决定基因sry同源性最高的一个,因此吸引着众多研究者的目光。在小鼠中sox3被证实与性腺发育息息相关,与配子发生有着紧密的联系,在鱼类中sox3被证实与生殖细胞的发育有关,在恒河青鳉中是重要的雄性性别决定基因。但是诸多研究中sox3都没有一个准确的表达模式。因此,发现和确定sox3基因的表达模式对进一步研究其功能是十分必要的。青鳉是小型淡水鱼,其个体小、胚胎透明、繁殖快、基因组小,是研究发育生物学和细胞生物学优秀的模式物种。青鳉是第一个发现雄性性别决定dmy基因的非哺乳动物,也是唯一一个拥有雌性性别决定基因foxl3的脊椎动物,同时有着许多在性腺中特异表达的转基因品系,这就为研究生殖和性腺发育相关基因的功能提供了良好的平台。除此之外,很多科研工作者致力于在青鳉中研究生殖相关的基因,很多生殖细胞标记基因被成功发现,比如dazl、dnd、piwi和vasa,并成功建立转基因品系。Cas9等最新的敲除技术也已在青鳉中成功应用,因此,青鳉是一个很适合研究性腺发育和性别分化的模式物种。本研究克隆了青鳉sox3基因,其cDNA长为1786 bp,其中包括191 bp的5’UTR区,912 bp可编码303个氨基酸的CDS区以及683 bp的3’UTR区。生物信息学分析显示sox3在不同物种间具有较高的保守性,与哺乳动物中的sox3基因有着高于70%的相似度。氨基酸序列比对,系统发育进化树均显示sox3在进化地位上极为保守。染色体线性分析结果显示,青鳉sox3在染色体位置上与其他脊椎动物包括人类,斑马鱼等存在着一致性,多个分析结果都显示sox3在进化上高度保守。RT-PCR结果显示,sox3在脑、眼睛以及性腺表达,脑和眼睛是神经系统丰富的组织,该结果也与胚胎原位杂交结果一致,预示着sox3在神经系统中有着重要的作用。性腺切片原位杂交结果显示,sox3在卵原细胞及早期卵细胞中有着较高的表达。但与vasa不同,sox3在后期卵细胞的颗粒细胞以及膜细胞中表达。sox3在精原细胞中并未明显检测到,但在发育后期的精细胞中有着较高的表达,在类染色体部位检测到特异的信号。预示着sox3在配子发生和成熟中承担着重要的作用。胚胎结果预示着sox3在神经系统发育中有着重要的作用,荧光素酶报告显示miR-375-3p类似物能够有效抑制荧光素酶的活性,预示着sox3存在miR-375-3p的结合位点。sox3在青鳉中表达模式研究,同时结合miRNA,有助于理解sox3在脊椎动物生殖发育中的分子机制和作用,同时也为为进一步了解青鳉性腺发育和相关基因功能的研究作了良好的铺垫。
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:S917.4

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