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《上海海洋大学》 2019年
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草鱼2个Gadd45-Beta基因亚型的克隆、表达及对比性功能研究

白玉麟  
【摘要】:草鱼(Ctenopharyngodon idella)是中国经济上重要的淡水鱼类,占淡水渔业总产量的比例较高,但由于水中的病原体引起各种病害的频发给产值造成了一定的影响。先天免疫是鱼类免疫系统的重要防线,能够通过模式识别受体(PRRs)识别病原体结构,从而诱导机体产生免疫反应。因此,有必要研究草鱼的先天免疫基因,为培育抗病能力较强的草鱼新品种提供新的思路。生长停滞和DNA损伤诱导45-Beta(Gadd45B)对丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性至关重要,并参与调节生长,凋亡和DNA去甲基化。在本研究中,克隆了草鱼中gcGadd45Ba和gcGadd45Bb基因的全长cDNA,分析序列并用嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)作为病原体模型处理草鱼个体和细胞,研究这些基因在草鱼个体及细胞在细菌感染后的的表达情况,并设计实验通过构建过表达载体以及重组蛋白对基因的功能进行探究,取得了如下的结果:1.从草鱼转录组中获得gcGadd45Ba和gcGadd45Bb的cDNA短片段,设计引物验证其准确性,并通过RACE技术获得全长序列。gcGadd45Ba的全长cDNA为1279bp,包括650bp的5'-非翻译区(UTR),149bp的3'-UTR,以及480bp的ORF,编码159个氨基酸的蛋白质,分子量为17.91 kDa,理论等电点为4.38。gcGadd45Bb的全长cDNA为1190bp,包括564bp的5'-UTR,140bp的3'-UTR和486bp的ORF,它编码的蛋白质为161个氨基酸,分子量为17.97kDa,理论等电点为4.51。分析其氨基酸序列得知,gcGadd45Ba编码的蛋白质不具有疏水区域,gcGadd45Bb编码的蛋白质具有弱疏水区域,为我们合成其可溶性重组蛋白提供了可能。2.gcGadd45Ba和gcGadd45Bb正常组织荧光定量PCR结果显示它们在草鱼的所有测试组织中表达。且gcGadd45Ba基因表达在肝脏,心脏,肌肉,皮肤,血液和脾脏中相对较高。gcGadd45Bb基因在血液,鳍,心脏和脾脏中的表达相对较高。除了鳍和鳃之外,gcGadd45Ba和gcGadd45Bb的水平在所有测试组织中显示出显著差异。免疫组织的表达量结果显示嗜水气单胞菌感染后gcGadd45Ba和gcGadd45Bb有显著的免疫应答,4 h和12 h之间的表达水平呈上升趋势,12 h和72 h之间逐渐下降,并且gcGadd45Ba存在在脾脏中高度表达,gcGadd45Bb在头肾中高表达的现象。3.通过构建gcGadd45Ba和gcGadd45Bb的过表达载体,转染CIK细胞后检测下游相关免疫因子(IL-8、IL-1β、TNF-α)的转录情况,结果表明,该途径下游的免疫因子的转录可以被显著激活。并且在抑菌实验中可以看出,在过表达目的基因的CIK细胞能够显著的抑制细菌入侵效率。4.在草鱼体外表达并纯化gcGadd45Ba和gcGadd45Bb的重组蛋白,设计血细胞吞噬细菌的实验,通过使细菌携带FITC荧光标记,通过流式细胞术测量荧光信号以测量重组蛋白对血液吞噬细菌效率的影响。结果显示gcGadd45Ba和gcGadd45Bb均存在血清依赖性的促血细胞吞噬作用。
【学位授予单位】:

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1 白玉麟;草鱼2个Gadd45-Beta基因亚型的克隆、表达及对比性功能研究[D];上海海洋大学;2019年
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